Experimentelle Arbeiten zur Transplantation allogener Keratinozyten auf künstlich erzeugte Narben von weißen Ratten

Der Wunsch, das zelluläre Potenzial zu nutzen und die Notwendigkeit, neue wirksame Methoden zur Verbesserung des ästhetischen Erscheinungsbilds von Narben zu finden, führten zu der Idee, die Möglichkeit der Transplantation von Keratinozyten auf Narbenoberflächen zu untersuchen.

Um die Wahrscheinlichkeit zu beweisen, dass die Verwendung von Keratinozytenkulturen zur Verbesserung des Erscheinungsbilds von Narben möglich ist, wurde eine experimentelle Studie an weißen Laborratten durchgeführt, bei denen Narbenoberflächen erzeugt wurden. Das Rattennarbenmodell entstand durch die Heilung künstlich zugefügter Wunden auf dem Rücken entlang der Wirbelsäule. Den Ratten wurden identische Hautstücke im Format 2 x 3 cm ausgeschnitten. 2,5 Monate nach der Operation zur „Narbenmodellierung“ wurden die Ratten einer Dermabrasion (Entfernung der oberen Narbenschichten mittels Thermokaustik) unterzogen und allogene Keratinozyten transplantiert, die aus der Haut von Rattenjungen 2–4 Tage nach der Geburt isoliert wurden.

Die Isolierung und Kultivierung von Rattenepidermiszellen wurde im Labor für Zelltechnologien des Instituts für Zytologie der Russischen Akademie der Wissenschaften unter Verwendung der folgenden Technologie durchgeführt.

Die Haut wurde in Hanks Kochsalzlösung mit 200 U/ml Gentamicin gewaschen und in kleine Stücke mit einer Fläche von 0,2 bis 0,5 cm² geschnitten ^. Die Hautstücke wurden 1 Stunde lang in einer 0,5%igen Dispase-Lösung in einer phosphatgepufferten Salzlösung bei 37 °C inkubiert. Die Stücke wurden dann in Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung überführt und die Epidermis von der Dermis getrennt. Die Epidermis wurde 10 bis 15 Minuten lang in einer 0,125%igen Trypsinlösung unter Rühren bei 50 U/min inkubiert, wonach die Enzymwirkung durch Zugabe von 5% fötalem Rinderserum gestoppt wurde. Ein Drittel der resultierenden Zellsuspension wurde in reiner Form für eine der Optionen zur Transplantation auf Narben verwendet, das zweite Drittel wurde auf biokompatiblen Haushaltsfilmbeschichtungen „Polypor“ gezüchtet und das dritte – auf Petrischalen ohne Substrat. Die Operation der Dermabrasion der entstandenen Narben bei Ratten mit anschließender Transplantation von Rattenepidermiszellen wurde unter Etheranästhesie mittels Thermokauter durchgeführt.

Bei der ersten Rattengruppe wurden nach der Dermabrasion sterile Batiststücke auf die polierte, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschene und getrocknete Narbenoberfläche gelegt. Darauf wurde eine geschüttelte Suspension allogener Rattenepidermozyten in einer Konzentration von 1,5 Millionen Zellen pro ml (laut Institut für Zytologie) aufgetragen. Die Batiststücke wurden so auf die polierte Narbe gelegt, dass die Zellen auf der Narbenoberfläche lagen. Darüber wurde ein Verband aus mehreren Lagen Gaze gelegt, der an die Narbenränder genäht wurde.

Ein Teil der erhaltenen Zellsuspension wurde in Petrischalen auf sterilen, auf die Form der Schalen zugeschnittenen Polypore-Folien ausgesät, der andere Teil auf Petrischalen ohne Folie. Die Kultivierung erfolgte in FAD-Medium, das aus einer Mischung von DMEM und F12-Medium im Verhältnis 3:1 besteht, unter Zusatz von 10 % fötalem Rinderserum, 5 µg/ml Insulin (Sigma), 0,5 µg/ml Hydrocortisonhemisuccinat (Sigma), 10 µg/ml epidermalem Wachstumsfaktor EGF (Institut für Zytologie der Russischen Akademie der Wissenschaften, St. Petersburg). Die zweite und dritte Gruppe von Ratten, jeweils 7 Tiere, wurden 6 Tage nach der ersten operiert. Zu diesem Zeitpunkt hatten sich in den Petrischalen aus der Suspension der ausgesäten Keratinozyten mehrschichtige Schichten gebildet, die den Ratten transplantiert wurden. Der zweiten Gruppe wurden Epidermozyten auf einer Folie transplantiert, der dritten eine mehrschichtige Schicht ohne Substrat. Nach 7 Tagen wurden die erhaltenen mehrschichtigen Schichten allogener Keratinozyten (MPALK), die auf den „Polypore“-Folien ausgesät waren, als Kultur direkt auf die Wundoberfläche transplantiert. Darüber wurde die Folie, um ein Abreißen zu verhindern, mit einem mehrlagigen Mullverband fixiert und auf die Haut der Ratten genäht.

Vor der Transplantation von Keratinozyten in die dritte Gruppe von Ratten, die ohne Substrat aufgewachsen waren, wurde das PAC durch Behandlung mit Dispase vom Boden der Petrischale getrennt. Dispase kann selektiv dermoepidermale Bindungen aufbrechen. Beim Einwirken auf eine mehrschichtige Schicht zerstört Dispase die Verbindung der Zellen der Basalschicht mit dem Boden der Petrischale und hat einen viel geringeren Effekt auf die interzellulären Verbindungen, wodurch die Schicht vollständig „entfernt“ werden kann. Das Ablösen der mehrschichtigen Zellschicht mit Dispase wurde wie folgt durchgeführt. Das Transportmedium wurde aus den Petrischalen abgelassen und die Zellschichten dreimal mit einem Nährmedium gewaschen, das Antibiotika, insbesondere Gentamicin (0,2 mg/ml), enthielt. Die mehrschichtigen Schichten wurden mit 0,125%iger Dispase-Lösung („Sigma“) gefüllt und in einen Thermostat gestellt, wo sie 20–30 Minuten bei t = 37 °C inkubiert wurden. Das Auftreten eines weißen Randes, der sich entlang der Peripherie der Schicht ablöst, ist ein Indikator für den Beginn des Prozesses ihrer Ablösung von den Rändern und dem Boden der Petrischale. Einige Minuten nach Beginn des Trennprozesses wurde die Dispase-Lösung abgelassen und die Epithelschichten 2-3 Mal mit dem Medium gewaschen. Ein auf Bechergröße zugeschnittenes Stück sterilen Wundverbandes „Lita-color“ wurde auf die Oberfläche der Epidermisschicht aufgebracht, auf die die durch Dispase abgetrennte Schicht geklebt wurde, die zusätzlich mit einem Spatel vom Becherboden abgezogen wurde. Mit einer Augenpinzette wurde die Schicht zusammen mit der Beschichtung der Serviette „Lita-color“ (Russland) vom Boden der Petrischale abgerissen und vorsichtig auf die vorbereitete Narbenoberfläche übertragen. Die Tücher „Lita-color“ enthalten Gentamicin und Exolin (Kollagenextrakt), die beim Befeuchten mit den Resten des Nährmediums und anschließend mit einer physiologischen Lösung aufquellen und zu einem modernen Wundverband werden, der aufgrund seiner feuchtigkeitsabsorbierenden Struktur einen guten Schutz vor äußeren Infektionen und eine schnelle Heilung bietet.

Mehrlagige Mullbinden wurden auf die Polypore-Folien und Lita-Color-Servietten aufgebracht und zur festeren Fixierung auf die Haut der Ratten genäht. Jede Ratte wurde in einen separaten Käfig gesetzt, um optimale Bedingungen für ihren Erhalt und die Anwachsung der transplantierten Keratinozyten zu schaffen. Die Verbände der Ratten, denen die Suspension und die durch Dispase entfernte mehrlagige Schicht aus Epidermozyten transplantiert wurden, wurden mehrmals täglich mit steriler Kochsalzlösung befeuchtet, um optimale Bedingungen für die Anwachsung der Zellen zu schaffen. Da die Polypore-Folie wasserundurchlässig ist, wurden die Verbände der Ratten der zweiten Gruppe nicht befeuchtet, was einen der Vorteile gegenüber Transplantationen ohne Folien darstellte. Die Verbände wurden nach 10 Tagen entfernt. Das klinische Bild der Narben nach Zelltransplantation unterschied sich kaum von Narben ohne Transplantation, abgesehen von ihrer rosafarbeneren Farbe (aufgrund der Dermabrasion) und stärkeren Abschälung. Diese Tatsache legt nahe, dass. dass unmittelbar nach dem Ablösen der Wundauflagen mit dem MPC keine Veränderungen an der Narbe auftraten.

Entnahme von Biopsiematerial von Ratten.

1, 2, 5 und 9 Monate nach der Transplantation allogener Rattenkeratinozyten auf polierte Narben weißer Ratten wurde Material für histologische, zytomorphologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen entnommen. Proben normaler Rattenhaut und Narben ohne Zelltransplantation dienten als Kontrolle. Die Anästhesie der Ratten erfolgte mittels Etheranästhesie.

Nach der Anästhesie wurden aus den markierten Bereichen Narbengewebestücke entnommen, in die Keratinozyten mit einer Biopsiestanze mit 2 mm Durchmesser transplantiert und in eine 2,5%ige Glutaraldehydlösung gelegt wurden, um das Material für die elektronenmikroskopische Untersuchung vorzubereiten. Für die histologische Untersuchung entnommene Gewebestücke wurden in eine 10%ige neutrale Formalinlösung gelegt, anschließend durch Alkohole geleitet und in Paraffin eingebettet. Anschließend wurden ultradünne Schnitte geschnitten und unter einem Lichtmikroskop betrachtet.

Kontrolle I. Normale Rattenhaut.

Um den Unterschied zwischen dem mikroskopischen Bild normaler, durch Narben veränderter Rattenhaut und Narben zu bestimmten Zeitpunkten nach der MPC-Transplantation zu erkennen, werden in allen Stadien dieser Studie Fotos und Beschreibungen davon gezeigt.

Die Epidermis normaler Haut besteht aus 7–9 Zellschichten. Die Hornschicht ist mäßig dick. An manchen Stellen besteht sie aus 6–8 Schichten Hornschuppen. Die Basalschicht besteht aus zylindrischen Zellen mit großen, hellen, regelmäßig geformten Kernen und mehreren Nukleolen. Desmosomale Verbindungen zwischen den Zellen und mit der Basalmembran sind deutlich ausgeprägt. Unter der gut abgegrenzten Basalmembran, die kleine Auswüchse in der subepidermalen Schicht aufweist, liegen parallel dazu zarte Bündel aus Kollagen- und Elastinfasern, darunter verlängerte Fibroblasten und kleine Gefäße. In tieferen Schichten liegen Bündel aus Kollagen- und Elastinfasern in unterschiedlichen Richtungen. Darunter befinden sich viele Gefäße mit dünnen Wänden gleichen Kalibers, Zellelemente (Fibroblasten, Mastzellen, Leukozyten). Eine große Anzahl von Haarfollikeln und Talgdrüsen.

Kontrolle 2. Rattennarbe, 2 Monate alt.

Klinisches Bild. Die Narben sind blassrosa, schälen sich ab, stellenweise bilden sich Krusten. Ihre Fläche hat sich aufgrund der Kontraktion der Kollagenfasern verringert und beträgt ca. 3,0–3,5 cm ^. Hautanhangsgebilde fehlen.

Mikroskopische Aufnahme. Die Epidermis besteht aus 3–5 gefalteten Zellschichten, dargestellt durch abgerundete Basalzellen, eine Reihe pfriemlicher Zellen, 1–2 Reihen körniger Zellen mit Keratohyalinkörnern in der oberen Schicht; es gibt Bereiche mit intrazellulärem Ödem. Das Stratum corneum verändert sich ungleichmäßig von sehr dünn zu verdickt. Narbenfalten entstehen durch (Kontraktion) des Narbengewebes. Die Falten dringen bis zur Papillarschicht vor und erwecken den Eindruck von Papillen. Die Grenze zwischen Epidermis und Dermis ist geradlinig. Die Basalmembran ist nicht überall nachgezeichnet. Im unteren Teil der subepidermalen und tieferen Schichten befinden sich Gefäße mit einer dicken, aufgelockerten Wand, viele sind verödet und stagnierend. Um die Gefäße herum sammelt sich eine Ansammlung von Makrophagen und Fibroblasten. Makrophagen umgeben die aus den Kapillaren freigesetzten Erythrozyten und phagozytieren sie. In den oberflächlicheren Schichten befinden sich kleine Kapillaren. Unter der Epidermis liegen lose Kollagenfasern. In der tieferen Schicht der Narbe finden sich grobe Bündel von Kollagenfasern, unter denen sich viele Fibroblasten befinden.

Rattennarbe einen Monat nach der Transplantation von Rattenkeratinozyten.

Klinisches Bild. Die Narben sind rosa, ihre Fläche hat sich verringert, insbesondere im Durchmesser, und beträgt durchschnittlich 2,5–3 cm² ^. Haare und Talgdrüsen fehlen.

Die Daten der mikroskopischen Untersuchung des von Ratten mit Transplantation von MPaLK auf Film und MPaLK ohne Substrat gewonnenen Materials sind praktisch identisch. Rein technisch gesehen ist die Arbeit mit MPaLK ohne Substrat jedoch viel komplizierter und mühsamer als die Züchtung von MPaLK auf einem Substrat. Daher verwendeten wir bei der weiteren Untersuchung der Transplantation von Keratinozyten in Narben mehrschichtigen Kambrium als Züchtungsgrundlage („Substrate“).

Mikroskopische Aufnahme. Es ist eine Verdickung der Epidermis auf 15–20 Schichten zu beobachten, wobei die Keratinozyten fast bis zur Mitte schmal, länglich, vertikal und kompakt angeordnet sind. Die Basalzellen sind unregelmäßig angeordnet. Ihre Kerne sind hell, groß, abgerundet und weisen ein oder zwei Nukleolen auf, was auf ihre hohe synthetische und proliferative Aktivität hinweist. Die Grenze zwischen Epidermis und Dermis ist geradlinig. Die Dornschicht ist gut entwickelt und besteht aus drei bis fünf Schichten abgerundeter Zellen. Es gibt zwei Nukleolenzellen.

Unmittelbar unter der Basalmembran befinden sich dicht angeordnete dünne Bündel von Kollagenfasern, parallel dazu eine große Anzahl verlassener Gefäße; tiefer gelegene Kollagenfasern sind gröber und in dichten Bündeln zusammengefasst. Viele große Fibroblasten, Mastzellen (2–3 im Sichtfeld), Makrophagen, Leukozyten und verlassene Gefäße, deren Wände gelockert sind, um sie herum befinden sich lose Kollagenfasern. In einigen Gefäßen kommt es zu Stase und Diapedese geformter Elemente. Um die Gefäße herum befinden sich Fibroblasten und einzelne Lymphozyten. Hautanhangsgebilde fehlen.

Bei der Transplantation einer Keratinozytensuspension auf eine polierte Narbe unterscheidet sich das mikroskopische Bild vom vorherigen. Bei den meisten Tieren ist die Epidermis dünn und besteht aus 5–6 Zellschichten. Die untere Schicht besteht aus unregelmäßig polygonalen Zellen mit rundlich-unregelmäßig geformten Kernen. Der Zustand der subepidermalen Schicht ähnelt dem in der Tiergruppe ohne MPALK-Transplantation.

In diesem Fall kann es entweder zu einer Verzögerung der mit der Zelltransplantation einhergehenden Prozesse oder zu einem großen Verlust der in Form einer Suspension transplantierten Zellen kommen. Daher wurde der Schluss gezogen, dass eine Narbenkorrektur durch die Transplantation von Keratinozyten in Form einer Suspension nicht sinnvoll ist.

Rattennarbe 2 Monate nach der Transplantation von Rattenkeratinozyten.

Klinisches Bild. Die Narbe sieht dünn und zart aus. Stellenweise sind Abschuppungen und schuppige Stellen zu beobachten.

Mikroskopische Aufnahme. Die Hornschicht ist stellenweise verdickt – Hyperkeratose. Die Epidermis ist verdickt und besteht aus 12–20 Zellreihen. Die Grenze zwischen Epidermis und Dermis ist eine gerade Linie. Zarte Kollagenfasern liegen recht dicht unter der Epidermis. In den tieferen Schichten der Narbe sind sie in großen, groben Bündeln gesammelt. In der subepidermalen Schicht bilden sich neue Gefäße. In den unteren Schichten des Narbengewebes befinden sich viele verlassene Gefäße parallel zur Oberfläche der Epidermis. Große Fibroblasten sind gleichmäßig in der Narbendicke verteilt, es gibt riesige, vielverzweigte, zahlreiche Makrophagen.

Rattennarbe 5 Monate nach der Transplantation von Rattenepidermiszellen.

Klinisches Bild. Die Narbe sieht ebenmäßig und glatt aus, ohne sich abzulösen. Es sind einzelne Haare vorhanden, deren Dichte am Rand der Narbe größer ist, was auf ein marginales Einwachsen von Haarfollikeln in die Narbe und die Neubildung von Haarfollikeln hindeutet. Die Narbenfläche nimmt kontinuierlich ab.

Mikroskopische Aufnahme. Die Epidermis ist noch dick (15–20 Schichten, stellenweise bis zu 30). In den oberen Schichten ist sie mit Keratohyalin-Körnern gefüllt. Die Basalmembran ist deutlich sichtbar. Darunter liegen lose Kollagenfasern. In den unteren Schichten ist das Kollagen kräftiger und dichter gepackt. Zwischen den Kollagenbündeln befinden sich viele Kapillaren. In den oberen Schichten hat die Anzahl verlassener Gefäße abgenommen. Der Übergang zwischen Epidermis und Dermis ist leicht gewellt. Stellenweise finden sich tiefe epidermale Auswüchse im Narbengewebe. Zwischen den Kollagenfasern sind neu gebildete Gefäße sichtbar. Einzelne Haarfollikel und Talgdrüsen erscheinen.

Rattennarbe 9 Monate nach der Transplantation epidermaler MPA-Zellen von Ratten.

Klinisches Bild. Die Narben sind im Vergleich zu früheren Perioden deutlich kleiner geworden, ihre Fläche beträgt durchschnittlich etwa 1,5–2,0 cm² ^. Die Narben sind ungleichmäßig mit feinen Haaren bedeckt, insbesondere in der Peripherie. Es bleibt eine leichte feinflächige Ablösung.

Mikroskopische Aufnahme.

Die Epidermis ist dünner geworden, besteht aus 6–8 Zellreihen und ähnelt in ihrer Struktur der Epidermis normaler Rattenhaut, nur die Zelldichte ist 1 mm höher und die Zellen sind kleiner. Die Basalschicht besteht aus kleinen rundzylindrischen Zellen. Die Basalmembran ist gut ausgeprägt, Hemidesmosomen sind deutlich sichtbar. In der subepidermalen Schicht sind epidermale Auswüchse zu erkennen. Die Papillarschicht ist über die gesamte Länge der Narbe ausgeprägt. Diese Tatsachen weisen darauf hin, dass die Haftung der transplantierten Keratinozyten mit dem darunter liegenden Narbengewebe zu diesem Zeitpunkt deutlich stärker geworden ist. Daher kann die Narbenpflege bei Patienten mit MPALK-Transplantation 9 Monate nach einer MPC-Transplantation traditionell erfolgen. Unter der Epidermis sind die Kollagenfasern zarter als in den tiefen Schichten. Es sind viele, vor allem oberflächliche Gefäße erschienen. Die Wände größerer Gefäße sind verdickt. Haarfollikel und Talgdrüsen sind in großer Zahl vorhanden. Das mikroskopische Bild ähnelt dermisähnlichem Gewebe.

Ergebnisse experimenteller Arbeiten und deren Diskussion.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Keratinozyten in verschiedenen Formen auf künstlich erzeugte Rattenhautnarben nach Dermabrasion transplantiert – auf Wundauflagen, als Suspension auf Batist und als mehrschichtige Schicht ohne Substrat. Ziel der Arbeit war es, morphologische Daten zur Wirkung transplantierter allogener Keratinozyten auf Narben zu gewinnen und optimale Transplantationsoptionen zu bestimmen.

Es zeigte sich, dass alle drei Transplantationsmethoden durchführbar sind. Die Transplantation der MPAC ohne Substrat ist jedoch ein sehr arbeitsintensiver Vorgang, bei dem die MPAC beschädigt werden kann, was die Ergebnisse der Transplantation beeinträchtigt. Darüber hinaus ist bei dieser Transplantationsmethode die Arbeit an großen Flächen nicht möglich.

Die Transplantation einer Keratinozytensuspension ist eine deutlich kostengünstigere Methode, erfordert keine langfristige Zellkultivierung und ist in der von uns vorgeschlagenen Variante mit sterilen, der Narbengröße entsprechenden Batistrohlingen einfach durchzuführen. Die Verzögerung des therapeutischen Effekts bei der Transplantation einer Zellsuspension um etwa einen Monat im Vergleich zur MPC auf Wundauflagen ist bei einer Behandlungsdauer von mehreren Monaten unerheblich. Es ist bekannt, dass sich die Hautstruktur bei der MPC-Transplantation bei Verbrennungspatienten allmählich und über mehrere Jahre verändert. Die Transplantation einer Keratinozytenkultur auf Wundauflagen ist die bequemste und erfolgversprechendste Methode, aber auch deutlich teurer. Darüber hinaus erfordert sie derzeit die Suche nach fortschrittlicheren Beschichtungsoptionen, die flexibel, hygroskopisch, bakteriostatisch oder bakterizid und biologisch neutral für Zellen sein sollten. Die Folie „Polypor“ – eine Zwischenversion der herkömmlichen Folienwundauflage – ermöglichte es uns trotz einiger Unzulänglichkeiten, die Transplantation von Rattenkeratinozyten auf Narben experimentell zu untersuchen und Rückschlüsse auf die Wirksamkeit dieser Narbenbehandlungsmethode zu ziehen.

Die Autoren, die MPC auf Brandwunden transplantierten, stellten fest, dass sich die Epidermis innerhalb der ersten Woche nach der Transplantation einer mehrschichtigen Keratinozytenschicht auf desinfizierte Wunden verdickte und schichtete. Alle Schichten der Epidermis waren deutlich sichtbar. Interessanterweise war die Anzahl der Zellschichten in den Transplantaten um 10–30 % höher als in Hautbiopsien. Die Autoren stellten das Auftreten von Keratohyalin-Granula am fünften Tag nach der MPC-Transplantation fest, die Basalmembran und Hemidesmosomen bereits am dritten Tag.

J. Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) stellten fest, dass in den frühen Stadien nach der MPC-Transplantation bei Patienten mit vollschichtigen Hautdefekten nach Verbrennungen die Verbindung zwischen Dermis und Epidermis sehr schwach und geradlinig ist und die Papillarschicht fehlt. Gegen Ende des 2. Monats beginnen sich flache Papillen und Hautanhangsgebilde zu bilden, die Verbindung zwischen Dermis und Epidermis wird stärker. Literaturdaten zeigen, dass die Transplantation allogener Keratinozyten auf Wunden von Brandverletzten eine vielversprechende Methode ist. Obwohl es laut verschiedenen Autoren innerhalb von 10 Tagen bis 3 Monaten zu einer Abstoßung allogener Keratinozyten kommt, spielen diese dennoch eine Rolle bei der Heilung der Wundoberfläche, indem sie Wachstumsfaktoren absondern und den Defekt mechanisch schließen. Es wird angenommen, dass MPALC eine verringerte antigene Aktivität aufweisen, da sie während der In-vitro-Kultivierung Langerhans-Zellen verlieren, wodurch sie lange Zeit im Körper des Empfängers überleben können. Darüber hinaus verfügt eine allogene Kultur aus der Haut junger gesunder Menschen über ein unvergleichlich höheres biologisches Potenzial als eine autologe Kultur von Patienten nach einer Verletzung.

Das Hauptziel unserer Studie war es herauszufinden, ob allogene Keratinozyten auf Narben Wurzeln schlagen und welche Veränderungen im Narbengewebe unter dem Einfluss einer solchen biologisch aktiven „Wundbeschichtung“ auftreten. Im Falle eines positiven Ergebnisses wollten wir die effektivste und am wenigsten arbeitsintensive Technologie für diesen Bereich der Rehabilitationsmedizin entwickeln.

Die von uns erhaltenen Daten ähnelten in vielerlei Hinsicht den in der Literatur enthaltenen Daten zu morphologischen Veränderungen der menschlichen Epidermis nach der Transplantation allogener Keratinozyten in Brandwunden. Es gibt jedoch auch erhebliche Unterschiede sowohl hinsichtlich des morphologischen Substrats, auf das die Transplantation erfolgt, als auch hinsichtlich der Technologie. So findet der Prozess der Bildung der Basalmembran und der dermo-epidermalen Verbindungen (Hemidesmosomen, Papillen) im Vergleich zur Transplantation von Keratinozyten auf Wundoberflächen ohne narbige Veränderungen in einem späteren Stadium statt. Dies liegt offenbar an der schlechteren Ernährung des Narbengewebes im Vergleich zur Dermis oder Muskelfaszie. Eine Narbe, insbesondere eine alte, ist ein dichtes Bindegewebe mit einer sehr geringen Anzahl von Gefäßen, während der Boden einer Brandwunde ein gefäßreiches Granulationsgewebe ist. Es ist daher offensichtlich, dass die Bedingungen, unter denen die Transplantation und das Anwachsen von Keratinozyten erfolgen, völlig unterschiedlich sind. Je vaskularisierter der Bereich der Zelltransplantation ist, desto einfacher ist der Prozess ihrer Ansiedlung. Aus diesem Postulat folgt die Schlussfolgerung, dass die Arbeit mit jungen Narben bevorzugt wird, bei denen das Bindegewebe noch recht locker und gefäßreich ist.

Als Ergebnis dieser experimentellen Arbeit wurde bewiesen, dass:

1. Eine Transplantation von MPALK auf Narben ist möglich.
2. Die optimale Transplantationsmethode ist die Transplantation von Keratinozyten auf die Wundauflage.
3. Die Narbenoberfläche sollte mittels chirurgischer Laserdermabrasion oder einem Schumann-Cutter poliert werden.
4. Unter dem Einfluss von MPALK kommt es zu einer schnellen Epithelisierung der polierten Narbenoberfläche.
5. Je besser das Narbengewebe durchblutet ist, also je jünger die Narbe ist, desto besser sind die Ergebnisse der Keratinozytentransplantation.
6. Unter dem Einfluss transplantierter Keratinozyten wandelt sich das Narbengewebe allmählich um und verwandelt sich in ein dermales (lockereres Narbengewebe mit Hautanhangsgebilden).
7. Allmähliche Lockerung des Narbengewebes, beginnend mit der subepidermalen Schicht. Die Gefäßversorgung verbessert sich, die Kollagenfaserbündel im oberen und unteren Narbenbereich sind lockerer angeordnet als im Narbengewebe ohne Zelltransplantation. Haarfollikel und Talgdrüsen erscheinen. Die Epidermis nähert sich in ihrer Struktur nach der Hypertrophiephase der Epidermis normaler Haut an.
8. Die beobachteten Veränderungen stehen mit Wachstumsfaktoren und Zytokinen in Zusammenhang, die von Keratinozyten abgesondert werden. Diese verbessern den Trophismus des Narbengewebes und fördern dessen Umwandlung von grobem Fasergewebe in lockeres Gewebe, was zu einer Verbesserung des Erscheinungsbilds der Narbe führt.

Auf Grundlage dieser Studie kann daher der Schluss gezogen werden, dass transplantierte Keratinozyten eine positive Wirkung auf Narbengewebe haben, was praktische Auswirkungen auf die Rehabilitation von Patienten mit verschiedenen Arten von Narben haben kann.

Diese Arbeit an Ratten ermöglichte es uns auch, die Anforderungen an Wundabdeckungen zu formulieren, auf denen Keratinozyten gezüchtet werden.

Wundverbände sollten sein:

• biokompatibel mit Zellen,
• atmungsaktiv,
• haben eine elastische, formgebende Basis,
• hydrophil sein,
• als medizinische Zusatzstoffe enthalten sie antibakterielle Wirkstoffe und Antioxidantien, die für kultivierte Zellen nicht toxisch sind.

Klinische Ergebnisse der biotechnologischen Narbenbehandlung.

Zuvor fanden N. Carver et al. (1993) heraus, dass Okklusivverbände die Wundhaftung und das Überleben der Keratinozyten am besten fördern, aber die Bildung einer geschichteten (reifen) Epidermis verhindern. Für die Bildung einer geschichteten Epidermis ist eine luftige Umgebung notwendig. Daher wurde vorgeschlagen, nach dem Anbringen einer mehrschichtigen Schicht den Okklusivverband nach 7-10 Tagen zu entfernen und die Wunden mit trockenen Verbänden oder wasserlöslichen Salben zu behandeln. Man kann sagen, dass die Qualität und die Eigenschaften des „Substrats“, auf dem die Zellen gezüchtet werden, ein sehr wichtiger Punkt für die Wirksamkeit der Zellmaterialtransplantation und damit für die Ergebnisse der ärztlichen Arbeit sind. Doch trotz der Fülle vorgeschlagener Optionen (künstliche Haut, Vliesstoff aus Carboxymethylcellulose, Fibrinbeschichtungen, semipermeable Polyurethanfolien) gibt es heute keinen idealen Wundverband. Ein wichtiger Punkt in diesem Zusammenhang sind die Kosten für „Substrate“ (spezielle Wundauflagen), da ihre hohen Kosten die Gesamtkosten der biotechnologischen Behandlung erhöhen.

Die Wirksamkeit von Zelltechnologien ist zwar erwiesen, doch leider sind diese Technologien sehr teuer, insbesondere in Ländern, in denen die industrielle Produktion von Zellzusammensetzungen noch nicht etabliert ist. Länder wie die USA haben jedoch seit langem eine Industrie zur Herstellung von Zellmaterial für die Verbrennungstransplantation etabliert. Insbesondere hat die Firma BioSurface Technology Inc. seit 1989 37.000 mehrschichtige Keratinozytenschichten gezüchtet, mit denen 240 Patienten in 79 Ländern weltweit behandelt wurden (R. Odessey, 1992), während 1 cm² ^Zellkultur etwa 7–8 US-Dollar kostet.

Die Technologie zur Behandlung verschiedener Hautkrankheiten und -probleme weist eine Reihe von Unterschieden auf, aber jede Zellbehandlung basiert auf der Gewinnung hochwertigen Zellmaterials und dessen Transplantation.

Dieser Prozess besteht aus den folgenden Schritten:

• Entnahme von Haut von Opfern (oder von Spendern),
• Transport von Hautlappen zu einem Biotechnologiezentrum,
• Isolierung von Basalschichtzellen und deren Proliferation,
• Wachstum mehrschichtiger Keratinozytenschichten (MLK).
• Zellkulturtransplantation.

Das Hauptproblem bei der Behandlung mit der Transplantation mehrschichtiger Keratinozytenschichten ist der Bedarf an lebensfähigen Zellen in allen Stadien der Zelltransplantation. Hautstücke zur Isolierung autologer oder allogener Zellen sollten möglichst dünn sein, da sie sich dann leichter mechanisch und enzymatisch trennen und eine Suspension lebender Zellen für die Kultivierung erhalten lassen. Sie können durch Schneiden mit einem Dermatom oder aus der Haut der Augenlider, der Vorhaut und der Innenseite der Schulter gewonnen werden. Da die Zellen empfindlich auf Halogene (Chlor, Jod) und Wasserstoffperoxid reagieren, können sie bei der Verarbeitung der Haut während der Materialentnahme nicht verwendet werden.

Die quantitative und qualitative Ausbeute an Zellen aus Hauttransplantaten sowie die Effizienz ihrer Kultivierung hängen auch vom Gesundheitszustand und Alter des Spenders ab. Darüber hinaus müssen Hautbiopsien so schnell wie möglich und unter geeigneten Bedingungen (Umgebung, Temperatur) an ein für diese Zwecke zertifiziertes und akkreditiertes Labor geliefert werden.

Zur Lagerung und zum Transport von Hautlappen können Eagle-Medium oder Medium 199 mit Zusatz von 10 % Rinderserum, DMEM-Medium mit Zusatz von 5 % fötalem Rinderserum und Antibiotika verwendet werden.

Im zytologischen Labor wird die Hautbiopsie zunächst mechanisch in kleine Stücke zerteilt, dann werden die Hautstücke mit Hilfe von Enzymen verarbeitet: Trypsin, Kollagenase, Dispase usw.

Unter der Einwirkung von Enzymen werden Desmosomen zerstört und Keratinozyten in Form einzelner Zellen oder Aggregate aus unterschiedlicher Zellzahl in das Medium freigesetzt. Zur Kultivierung werden nur basale Keratinozyten verwendet, die auf speziellen Medien in Thermostaten mit 5 % CO, in Petrischalen oder in Kolben bei t = 37 °C gezüchtet werden. Bereits nach 48 Stunden ist die Bildung von Keratinozytenkolonien zu beobachten, die sich allmählich zu einer Monoschicht zusammenschließen. Nach Erhalt einer ausreichenden Zellzahl wird die resultierende Suspension auf zu diesem Zweck vorbereitete Wundauflagen ausgesät und in Petrischalen gegeben. Aus der Suspension bildet sich zunächst eine Monoschicht und dann eine mehrschichtige Schicht aus Keratinozyten. Die Stadien des Keratinozytenkultivierungsprozesses sind in Abb. 12 (33,43,54,65) schematisch dargestellt.

Die Bildung einer für die Transplantation geeigneten mehrschichtigen Keratinozytenschicht dauert in der Regel 7–10 Tage. Manchmal kann dieser Zeitraum länger sein, abhängig von der Qualität des Ausgangsmaterials (Alter, Gesundheitszustand des Spenders, Richtigkeit der Materialentnahme, Qualität des verwendeten Mediums usw.). Wenn die mehrschichtige Schicht überwuchert, können auf ihrer Oberfläche Zellen mit Apoptose-Phänomenen erscheinen, die für die Transplantation ungeeignet sind. Petrischalen mit darin auf Wundauflagen gezüchteten mehrschichtigen Keratinozytenschichten (MLK) werden in speziellen Behältern bei einer Temperatur von mindestens +15 °C an die Klinik geliefert.

Modifizierte Green-Methode zum Züchten von MPC

In unserer Arbeit verwendeten wir mehrschichtigen Batist als Wundabdeckung und verzichteten auf die „Polypor“-Folien, mit denen wir im Rattenexperiment begonnen hatten. Daher züchteten wir mehrschichtige Keratinozytenschichten auf vorentfettetem und sterilem Batist, obwohl auch dieser keine optimale Wundabdeckung darstellt.

Die klinischen Studien wurden an Freiwilligen unter Einhaltung der erforderlichen ethischen Standards durchgeführt: Unterzeichnung einer Vereinbarung und Einverständniserklärung.

1. Es wurde eine Kultur patienteneigener (autologe) und gelagerter (allogener) Keratinozyten verwendet.
2. Die patienteneigenen Keratinozyten wurden aus einem Hautstück gewonnen, das von der Innenseite ihrer Oberarme abgeschnitten wurde.
3. Die Narbendermabrasion wurde mittels Thermokauterisation, rotierenden Scheiben und einem Erbiumlaser durchgeführt.
4. Es wurden Patientengruppen mit normotrophen, hypotrophen und hypertrophen Narben gebildet.

Der technologische Prozess zur Anwendung der Zelltechnologie zur Verbesserung des Erscheinungsbilds von Hautnarben bestand aus den folgenden Schritten:

1. Patientenauswahl.
2. Erläuterungen zum Wesen der Behandlung, zum Zeitrahmen für das Erreichen der erwarteten Ergebnisse, zur Unterzeichnung des Vertrags und zur Einverständniserklärung.
3. Verschreiben Sie den Patienten 2–3 Wochen vor der Operation dreimal täglich 1 Tablette Selmevit und dreimal täglich 1 Tablette Zinctheral.
4. Entnahme eines 2,0 cm langen und 0,7–1,0 cm breiten Hautstücks von der Innenfläche der Schulter, hoch, fast im unteren Teil der Achselregion, um autologe Keratinozyten zu erhalten.
5. In Fällen, in denen Patienten aufgrund der Möglichkeit einer linearen Narbe an der Schulterinnenseite eine Isolierung eigener Keratinozyten ablehnten, wurde Zellmaterial aus einer Zellbank entnommen (allogene Keratinozyten).
6. Keratinozyten wurden in einem für diese Art von Arbeit zertifizierten Labor isoliert und gezüchtet.
7. Nachdem eine ausreichende Menge MPC für die Transplantation auf die Narben gewonnen worden war, wurde in der Klinik ein Tag für die Operation festgelegt, wohin das Material in speziellen Behältern in Petrischalen gebracht wurde.
8. Es wurde eine Narbendermabrasion durchgeführt, Blutstillung durchgeführt, die polierte Oberfläche mit einer sterilen Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und anschließend die MPCs auf sterilem Kambrium „Cells Down“ darauf transplantiert. Das heißt, die Zellen, die sich oben im MPC befanden, befanden sich unten, angrenzend an die polierte Oberfläche.
9. Darüber wurde eine sterile Folie aufgebracht, die mit einer elastischen Binde oder einem elastischen Omnifix-Pflaster auf der Haut fixiert wurde. Anstelle der Folie können auch indifferente silikonhaltige Wundauflagen verwendet werden, beispielsweise Mepitel, Mepiform oder Silikongelfolien.

Nach 5–7 Tagen wird die Folie bzw. Silikonbeschichtung entfernt. Zu diesem Zeitpunkt sollten alle Keratinozyten auf die polierte Narbe gekrochen sein und sich an deren Oberfläche festgesetzt haben.

10. Das feuchte Milieu unter der Folie und der Silikonbeschichtung trägt aktiv dazu bei. Der ab diesem Zeitpunkt auf der Narbe verbleibende Batist kann mit Curiosin oder Chitosan-Gel getränkt werden. Dadurch bildet sich am zweiten Tag eine dichte Kruste, die zur Erleichterung des Patienten am besten mit einem elastischen, atmungsaktiven Pflaster wie Omnifix fixiert wird. Die atmungsaktive Kruste ermöglicht es der gebildeten Epidermis, sich zu differenzieren und zu einer reifen Epidermis zu entwickeln.

Abhängig von der Art der Narbe und der Tiefe der Narbe wird der Verband nach 8–10 Tagen abgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt weist die Epidermis 30–40 % mehr Zellschichten auf als normale Haut. Die Basalmembran ist noch nicht ausgebildet. Keratinozyten der verdickten Epidermis scheiden zahlreiche biologisch aktive Moleküle in das Narbengewebe aus.

Der Erfolg der biotechnologischen Narbenbehandlung hängt maßgeblich von der postoperativen Pflege ab. Zellkulturen sind eine sanfte Wundabdeckung, und in der Frühphase nach der Transplantation lassen sich die IPCs leicht vom darunterliegenden Gewebe ablösen. Daher wird Patienten empfohlen, die Narbe nach der Operation vorsichtig zu behandeln. 8–9 Monate lang nicht reiben, sondern vorsichtig mit kaltem, abgekochtem Wasser behandeln, um ein Abreißen der dünnen, neu entstandenen Epidermis zu vermeiden, die noch nicht fest mit dem darunterliegenden Gewebe verbunden ist.

Notiz.

Vor Operationen und während der Dermabrasion ist die Verwendung halogenierter Antiseptika und Oxidationsmittel (Iodopyron, Suliodopyron, Iodinol, Iodinat, Chlorhexidin, Wasserstoffperoxid) zulässig, vor der Zelltransplantation ist sie aufgrund ihrer zytotoxischen Wirkung streng kontraindiziert. Methylenblau und Brillantgrün sind ebenfalls zelltoxisch.

Um Infektionen, insbesondere bei hypertrophen Narben, zu vermeiden, kann das Operationsfeld mit Neomycinsulfat, Polymyxin oder Gentamicin behandelt werden. Sie haben keine zytotoxische Wirkung auf Keratinozyten.

Durch eine solche Behandlung wird ein dreifacher Effekt erzielt.

1. Einebnung der Narbenoberfläche.
2. Darüber entsteht eine Schicht neuer Epidermis normaler Dicke.
3. Umwandlung von Narbengewebe in hautähnliches Gewebe durch die Wirkung von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und anderen biologisch aktiven Molekülen, die von transplantierten Zellen abgesondert und von diesen stimuliert werden: Keratinozyten, Fibroblasten und Makrophagen.

Die Narbe wird weniger auffällig, elastischer, es erscheinen Poren und Vellushaare darin und die Pigmentierung kann aufgrund der Anwesenheit von Melanozyten im IPC wiederhergestellt werden.

All diese positiven Aspekte der Narbe treten jedoch nicht sofort auf. In diesem Zusammenhang ist es notwendig, die Patienten darauf hinzuweisen, dass der Prozess der Umwandlung von Narbengewebe in Hautgewebe langsam verläuft und das optimale Ergebnis einer solchen Behandlung frühestens nach 10-14 Monaten zu erwarten ist. Unmittelbar nach dem Entfernen der Verbände weisen die polierten Oberflächen eine ausgeprägte Polychromie auf, die umso heller ist, je tiefer die Politur durchgeführt wurde. Die geringsten Hautschäden werden beim Polieren normotropher Narben mit einem Erbiumlaser festgestellt. Die Farbe der Narben und der umgebenden Haut erholte sich innerhalb von 3 bis 8 Wochen. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahmen tritt manchmal eine postoperative Hyperpigmentierung auf, die innerhalb weniger Monate von selbst verschwinden kann.

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