Nicht-virale Gentherapie bietet Hoffnung bei chronischen Kreuzschmerzen

In einer kürzlich in der Fachzeitschrift Biomaterials veröffentlichten Studie entwickelten Forscher eine neuartige nicht-virale Gentherapie zur Behandlung von diskogenen Rückenschmerzen (DBP), indem sie den Transkriptionsfaktor Forkhead Box F1 (FOXF1) mithilfe künstlich erzeugter extrazellulärer Vesikel (eEVs) in degenerative Bandscheiben (IVDs) in vivo einschleusen.

Chronische Rückenschmerzen (LBP) stellen aufgrund der alternden Bevölkerung und zunehmender Opioidprobleme ein weltweit wachsendes Problem dar. Aktuelle Behandlungsmöglichkeiten umfassen kurzfristige Linderung oder teure Operationen. Dies unterstreicht den Bedarf an nicht süchtig machenden und weniger invasiven Therapien.

Aktuelle biologische Ansätze, darunter die Gabe von Wachstumsfaktoren, Zelltherapie und virale Gentherapie, können die Degeneration in Tier- und Menschenmodellen reduzieren. Probleme wie kurzfristige Effekte, geringe Langzeitwirksamkeit sowie unnötige Immunogenität und Onkogenität können jedoch die direkte Anwendung dieser Ansätze behindern.

In dieser Studie entwickelten die Forscher eine nicht-virale Gentherapie für die Bandscheibendegeneration (IVD) unter Verwendung von FOXF1-eEV.

Die Forscher transfizierten primäre embryonale Mausfibroblasten (PMEF) mit Plasmiden, die FOXF1 oder pCMV6 als Kontrolle enthielten, und charakterisierten eEV-Proben mithilfe eines Nanopartikel-Tracking-Assays (NTA).

Sie untersuchten die effiziente Beladung von eEVs mit molekularer Fracht mittels quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und konventioneller PCR. Eine Western-Blot-Analyse identifizierte FOXF1 und EV-spezifische Proteine in eEV-Formationen. Das Team verwendete Plasmide, die die oberen und unteren Polylinker-Regionen verstärken, um das Vorhandensein von FOXF1-Plasmid-DNA in Spenderzellen zu bestimmen und eEVs zu generieren.

Sie untersuchten die vollständige mRNA, die aus Plasmid-DNA in eEVs und Spenderzellen produziert wurde.

Forscher haben extrazelluläre Vesikel mit Transkriptionsfaktoren geschaffen, um die Gewebefunktion wiederherzustellen und die Schmerzreaktionen in einem Tiermodell von DBP zu verändern.

Sie identifizierten EVs für den Transport und die Verteilung von FOXF1 in beschädigte Bandscheiben in einem Mausmodell für diskogene Rückenschmerzen, um die Hemmung der Bandscheibendegeneration durch FOXF1-eEVs zu bestimmen.

Das Team kombinierte biomechanische Tests der Bandscheiben von Mäusen mit bildgebenden Verfahren, Veränderungen der extrazellulären Matrix (ECM) und einer nach 12 Wochen beurteilten Schmerzreaktion, um durch den therapeutischen Eingriff hervorgerufene Veränderungen in Struktur und Funktion sowie Schmerzen zu bestätigen.

Zu den präoperativen und postoperativen Schmerzbeurteilungen gehörten Mikrocomputertomographie (Mikro-CT), Magnetresonanztomographie (MRT), mechanische Tests, Alcianblau- (AB) und Picrosiriusrot- (PSR) Färbung, Dimethylmethylenblau-Test und Immunhistochemie (IHC).

Die Studie umfasste eine chirurgische Technik, bei der Forscher Mäusen Buprenorphin ER subkutan verabreichten, um postoperative Schmerzen zu lindern.

Das Team führte vor der Operation und alle zwei Wochen von vier bis zwölf Wochen nach der Operation Verhaltensbeurteilungen durch und verwendete dabei eine Reihe von Methoden, darunter den Open-Field-Test, die Kaltplatte, die Schwanzaufhängung und die Drahtaufhängung.

Der Open-Field-Test beurteilte die spontane Aktivität der Mäuse; Kaltplattentests maßen die thermische Hyperalgesie; Schwanzaufhängungstests maßen axialen Schmerz und Drahtaufhängungstests maßen die Kraft.

Zwölf Wochen nach der Operation sezierte das Team die Lendenwirbelsäule der Tiere mittels Femoralnerv- und Arterienverfolgung, um die Bandscheiben zwischen L4 und L5, L5 und L6 sowie L6 und S1 IVD zu identifizieren. Anhand der L5/L6 IVD beurteilten sie die Histologie und bestimmten den Glykosaminoglykan-Gehalt (GAG).

FOXF1 eEVs reduzierten die Schmerzreaktionen erheblich und stellten gleichzeitig die Struktur und Funktion der IVD wieder her, einschließlich einer verbesserten Bandscheibenhöhe, Gewebehydratation, des Proteoglykangehalts und der mechanischen Eigenschaften.

Die Studie konzentrierte sich auf die Freisetzung von FOXF1-beladenen eEVs aus primären Fibroblasten, die mit dem Transkriptionsfaktor FOXF1 transfiziert wurden. Quantitative RT-PCR zeigte einen signifikanten Anstieg der FOXF1-mRNA-Transkriptspiegel und der vollständig transkribierten FOXF1-mRNA-Spiegel im Vergleich zu pCMV6-transfizierten Zellen.

Die FOXF1-eEV-Therapie kann Schmerzreaktionen in einem lumbalen Bandscheibenpunktionsmodell bei Mäusen bis zu 12 Wochen lang reduzieren. Weibliche Mäuse zeigten in der mit FOXF1 behandelten Gruppe längere Anfallszeiten als in der verletzten Gruppe, die mindestens 12 Wochen nach der Behandlung anhielten.

Die FOXF1 eEV-Therapie verbesserte die Hydratation und Größe des IVD-Gewebes bei verletzten und degenerativen Tieren in vivo, während gleichzeitig der Hydratationsgrad und die T2-gewichtete Bildintensität der IVD-Scheibe aufrechterhalten wurden.

Das Team beobachtete jedoch eine Verringerung der Bandscheibenhöhe bei verletzten Tieren und bei mit pCMV6 eEV behandelten Tieren. Bei Mäusen, die mit FOXF1 eEV behandelt wurden, war 12 Wochen nach der Behandlung keine Verringerung der Bandscheibenhöhe zu verzeichnen. Das Geschlecht hatte keinen Einfluss auf die funktionellen Ergebnisse.

FOXF1 eEVs stellten die mechanische Funktion beschädigter und degenerierter IVDs in vivo wieder her. Unter axialer Belastung zeigten mit FOXF1 eEVs behandelte IVDs eine höhere normalisierte NZ-Steifigkeit im Vergleich zu beschädigten IVDs.

Unter Kriechbedingungen zeigten beschädigte IVDs erhöhte normalisierte Kriechverschiebungen, was auf eine Abnahme der normalisierten elastischen Kriechsteifigkeit hindeutet.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Reduzierung des GAG-Gehalts in beschädigten IVDs die mechanische Flexibilität erhöht, die eEV-Therapie jedoch den Verlust von Glykosaminoglykanen und die daraus resultierenden Veränderungen der mechanischen Funktion verhindert.

FOXF1 eEVs induzierten strukturelle und funktionelle Veränderungen bei IVD durch Erhöhung der Proteoglykan- und GAG-Spiegel.

Die Ergebnisse der Studie zeigten, dass mit Entwicklungstranskriptionsfaktoren beladene eEVs schmerzhafte Gelenkerkrankungen wie DBP behandeln können, indem sie diese Transkriptionsfaktoren mittels IVD in degenerative und schmerzhafte Gelenke einbringen.

Diese Strategie kann dazu beitragen, die durch die Krankheit verursachten strukturellen und funktionellen Anomalien zu reduzieren und die Schmerzreaktionen geschlechtsspezifisch zu regulieren.

Die Forscher empfahlen außerdem die Verwendung von Entwicklungstranskriptionsfaktoren wie FOXF1, um degenerative NP-Zellen in vivo in einen pro-anabolen Zustand zu versetzen. Weitere Studien sind erforderlich, um die therapeutische Wirksamkeit zu bestimmen.