Diagnose von Herpes

Die Herpesdiagnostik basiert auf der klassischen Virusisolierung auf sensitiven Zellkulturen, Immunfluoreszenz- und serologischen Methoden, der kolposkopischen Untersuchung und dem Einsatz moderner molekularbiologischer Methoden (PCR, Dot-Hybridisierung), die die Diagnose der gesamten Gruppe der Herpesviren, einschließlich der Typen HHV-6 und HHV-7, ermöglichen.

Labordiagnostische Methoden für eine Herpesinfektion

Die wichtigsten Methoden zur Isolierung von HSV oder zum Nachweis viraler Partikel und/oder ihrer Bestandteile	Hilfsmethoden zum Nachweis von Antikörpern gegen HSV in biologischen Flüssigkeiten des menschlichen Körpers
Isolierung von HSV in empfindlichen Zell- und Tierkulturen Direkte und Immunelektronenmikroskopie Direkte und indirekte Varianten des IPA IFA Molekularbiologische Methoden Latex-Agglutinationsreaktion	Neutralisationsreaktion RSC Bestimmung von Antikörpern gegen Nichtstrukturproteine von HSV-1,2

Es zeigte sich, dass Genitalherpes (GH) bei 76 % der Patienten durch HSV-2 und bei 24 % durch HSV-1 verursacht wird. GH als Monoinfektion trat nur bei 22 % der Patienten auf, in 78 % der Fälle wurden mikrobielle Assoziationen nachgewiesen. Bei 46 % der Personen wurde eine durch zwei Erreger verursachte Parasitozönose festgestellt, darunter Chlamydien in 40 % der Fälle. Gardnerella, Trichomonaden und Gonokokken wurden in Abstrichen seltener nachgewiesen.

Bei 27 % der Patienten war die Parasitozönose durch drei Erreger repräsentiert, bei 5,2 % durch vier Erreger. Darüber hinaus wurde am häufigsten eine Kombination von Chlamydien mit Gardnerella und Candida-Pilzen festgestellt. Diese Daten untermauern die Notwendigkeit einer gründlichen bakteriologischen Untersuchung von Patienten mit GH, um Kombinationen von Krankheitserregern zu identifizieren, sowie einer eingehenden Untersuchung der Pathogenese von Mischinfektionen des Urogenitaltrakts, die eine differenzierte komplexe Therapie der Herpesinfektion ermöglichen wird.

Materialien, die zur Isolierung von HSV in Abhängigkeit von der Lokalisation herpetischer Läsionen untersucht wurden

Lokalisierung von Läsionen	Vesikelinhalt	Zellabschabung				Zerebrospinalflüssigkeit	Bronchialaspiration	Biopsie	Blut
		1	2	3	4
Leder	+								+
Augen			+						+
Genitalien				+					+
Anus	+				+				+
Mund	+	+							+
ZNS	+					+		+	+
Lunge		+					+		+
Leber								+	+
Angeborener Herpes	+	+	+				+		+

Methoden der Labordiagnostik einer Cytomegalievirus-Infektion

Methoden	Erforderliche Zeit zum Erhalten der Ergebnisse	Hinweise
VIROLOGISCH
Elektronenmikroskopie	3 Stunden	Nicht sehr zugänglich
Virusisolierung in Zellkultur (VCI)	4-20 Tage	Standard, Langsam
Immunfluoreszenzfärbung von frühem AG mit monoklonalen Antikörpern	6 Stunden	Weniger spezifisch
ZYTOLOGISCH	2-3 Stunden	Weniger spezifisch
SEROLOGISCHE
RSC	2 Tage	Standard
RGA	1 Tag	Arbeitsintensiv
RIFF	6 Stunden	Einfach, spezifisch
NRIF	6 Stunden	Schwierig
RIMP	6 Stunden	Schwierig
ELISA (IgM, DO)	6 Stunden	Schnell, einfach
Immunoblot	6 Stunden	Teuer
MOLEKULARBIOLOGISCH
MG	5-7 Tage	Teuer, arbeitsintensiv
PCR	3 Stunden	Teuer

Methoden zur Diagnose des Herpes-Zoster-Virus

Diagnostische Methoden	Labortechniken
INDIREKT
Auswahl	Gewebekultur, Hühnerembryos, Labortiere, Ko-Kultur mit permissiven Zellen oder Helferviren
Identifizierung von Isolaten	Neutralisationsreaktion, RSC, IF, PIEF, Reaktion der Isolate, Präzipitation, Agglutination, IF
DIREKT
Zytologie	Abstriche: Farbimmunfluoreszenz
Histologie	Pathomorphologie der Zelle
Struktur	Embryonale Mikroskopie, Immunelektronenmikroskopie
Bestimmung von Antigenen	IF, PIEF, RIM, IFA
Bestimmung der lokalen Antikörperproduktion	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Molekularbiologische Ansätze	Molekulare Hybridisierung, PCR

Labordiagnostik einer Infektion durch das Herpes-Zoster-Virus

Diagnoseprobleme	Methoden	Erwartete Ergebnisse
Akute Primärinfektion	1	Erkennung in 2 Stunden
	2	Der Antikörperspiegel steigt langsam an
	3	3 Tage nach der Infektion vorhanden
Akute reaktivierte Infektion	1	Nachweis von UUU nach 2 Stunden
	2	Der Antikörperspiegel steigt langsam an
	4	4 Tage nach Auftreten des Ausschlags vorhanden

1. Bestimmung von Vesikeln des VEGF in Flüssigkeit;
2. Serologie: CSC, ELISA, zum Nachweis
3. Serologie: ELISA zum Nachweis von IgM;
4. Serologie: ELISA zum Nachweis von IgA, IgM.

Methoden zur Anzeige der Immunantwort auf eine Herpes-Zoster-Virusinfektion

Ansatz	Verfahren
Nachweis eines Anstiegs des Antikörpertiters in den zweiten Seren	RSK, RTGA, RPGA, IF-Neutralisationsreaktion, RIM, ELISA
Nachweis von Ig G, Ig A klassenspezifischen Antikörpern in der ersten Serumprobe	ELISA, IF, RIM, Latexagglutination

Interpretation der Ergebnisse der serologischen Untersuchung von Patientenseren auf Herpesvirusinfektionen (ELISA)

Name der Infektion/Markierung	Durchschnittliche Schwellenwerte für Infektionen
	Ergebnisse der Analyse	Interpretation
Zytomegalie Anti-CMV IgG (1-20 U/ml) Anti-CMV-IgM (100-300 %)	Positiv 1-6 Positiv 6-10 Positiv >10 Negativ Positiv 100-300 Negativ <90 Zweifelhaft 90-100	Remission Verschlimmerung der Krankheit Akute Phase der Krankheit Keine Infektion (Krankheit) Akute Phase der Krankheit Wiederholen Sie die Analyse nach 2-3 Wochen
Herpes simplex 1,2 Serotypen Anti-HSV 1/2 gesamt (100-900%)	Positiv 100-400 Positiv 400-800 Positiv >800 Negativ <100	Remission Verschlimmerung der Krankheit Akute Phase der Krankheit Keine Infektion (Krankheit)

In der Tabelle sind die wichtigsten Methoden der Labordiagnostik von Herpesvirusinfektionen sowie empfohlene biologische Materialien aufgeführt, die bei der Isolierung von HSV unter Berücksichtigung der Lokalisation herpetischer Läsionen untersucht werden.

Herpes-simplex- und CMV-Viren werden durch Infektion sensitiver Zellkulturen zuverlässig isoliert. So wurde bei virologischen Untersuchungen von 26 Patienten während der Rückfallphase in 23 Fällen (88,4 %) HSV auf einer sensitiven Vero-Zellkultur isoliert. Die infizierten Kulturen zeigten ein für HSV typisches Bild zytopathischer Aktivität – die Bildung mehrkerniger Riesenzellen oder eine Ansammlung runder und vergrößerter Zellen in Form von Clustern. In 52,1 % der Fälle konnten Herde zytopathischer Aktivität des Virus schon 16–24 Stunden nach der Infektion nachgewiesen werden. Nach 48–72 Stunden Inkubation der infizierten Kulturen war der Anteil an Materialien, die eine spezifische Zellzerstörung verursachten, auf 87 % gestiegen. Und nur in 13 % der Fälle wurden 96 Stunden oder später nach der Infektion oder bei wiederholter Passagierung positive Ergebnisse festgestellt.

Methoden der Labordiagnostik einer generalisierten Herpesinfektion

Die wichtigsten Methoden zum Nachweis (Isolierung) von Herpesviren, ihren Partikeln und ihren Komponenten	Hilfsmethoden zum Nachweis von Antikörpern gegen Herpesviren in biologischen Flüssigkeiten, zum Nachweis enzymatischer Verschiebungen im Blutserum
Isolierung von Herpesviren auf empfindlichen Zell- und Tierkulturen Direkte und Immunelektronenmikroskopie Direkte und indirekte Varianten der Immunperoxidase-Methode Direkte und indirekte Varianten der Fluoreszenzantikörper-Methode Varianten des Festphasen-Enzymimmunoassays Varianten der molekularen (DNA-DNA) Hybridisierungsmethode Polymerase-Kettenreaktion Latex-Agglutinationsreaktion	Neutralisationstest Komplementbindungstest Latex-Agglutinationstest Indirekte Version der Fluoreszenzantikörpermethode Indirekte Version der Immunperoxidasemethode Varianten des Festphasen-Enzymimmunoassays Immunblot- Methode Radiale Komplementbindungsmethode Bestimmung der Alanin- und Aspartat-Aminotransferase-Spiegel

Serologische Methoden werden zur Diagnose der infektiösen Mononukleose (einer durch EBV verursachten Infektion) eingesetzt. Geeignet sind die Paul-Bunnell-Reaktion mit Schaf-Erythrozyten, ein diagnostischer Titer von 1:28 oder höher in einer einzelnen Blutserumprobe oder ein vierfacher Anstieg der Antikörper bei der Untersuchung gepaarter Seren. Die Hoff-Bauer-Reaktion mit einer 4%igen Suspension formalinisierter Pferde-Erythrozyten wird verwendet. Das Ergebnis wird nach 2 Minuten ausgewertet; bei infektiöser Mononukleose ist die Reaktion hochspezifisch.

Derzeit wird ein Enzymimmunoassay (EIA) zur Diagnose der infektiösen Mononukleose entwickelt. Dabei werden IgG- und IgM-Antikörper im Patientenserum durch Inkubation mit EBV-infizierten Lymphoblasten und anschließende Behandlung mit fluoreszierenden Antikörpern bestimmt. In der akuten Phase der Erkrankung werden Antikörper gegen das virale Kapsidantigen mit einem Titer von 1:160 und höher bestimmt.

Mithilfe einer Reihe importierter kommerzieller Testsysteme können mit ELISA folgende Antikörper nachgewiesen werden: Antikörper gegen EBV-Hüllantikörper, Antikörper gegen frühes EBV-Antigen, Gesamtantikörper gegen frühes EBV-Antigen, die in der akuten Krankheitsphase sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma nachgewiesen werden, sowie begrenzte Antikörper gegen frühes EBV, die in der akuten Krankheitsphase sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma nachgewiesen werden, begrenzte Antikörper gegen frühes EBV-Antigen, die auf dem Höhepunkt der Krankheit nur im Zytoplasma nachgewiesen werden, und Antikörper gegen EBV-Kernantigen. Der Einsatz dieser Testsysteme ermöglicht die Differentialdiagnose einer Reihe von EBV-assoziierten Erkrankungen.

Nach einem positiven ELISA-Test, der Antikörper gegen EBV nachweist, wird eine bestätigende Immunoblot-Reaktion durchgeführt, die das Vorhandensein von Antikörpern gegen einzelne EBV-Markerproteine (p-Proteine) bestimmt: p23, p54, p72 (das Vorhandensein dieses Proteins weist auf die Möglichkeit einer EBV-Reproduktion hin), p138. Die oben genannten Labormethoden werden auch verwendet, um die Wirksamkeit der Behandlung zu überwachen.

Die Sensitivität virologischer Methoden beträgt 85–100 %, die Spezifität 100 %, die Untersuchungsdauer 2–5 Tage. In der Praxis wird häufig die direkte Immunfluoreszenzmethode (DIF) mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen HSV-1 und HSV-2 eingesetzt. Die DIF-Methode ist im klinischen Labor gut reproduzierbar, kostengünstig, die Sensitivität liegt über 80 %, die Spezifität 90–95 %. Die Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte zytoplasmatische Einschlüsse, morphologische Merkmale und den Anteil infizierter Zellen in Abstrichen aus Harnröhre, Gebärmutterhalskanal, Gebärmutterhals und Rektum.

Die PIF-Methode liefert einen Einblick in die morphologischen Eigenschaften von Zellen und Veränderungen in der Lokalisation von HSV-Antigenen. Neben direkten Anzeichen einer Zellschädigung durch Herpesviren (Nachweis spezifischer Lumineszenz) gibt es laut PIF-Daten auch indirekte Anzeichen einer Herpesinfektion:

• Aggregation von Kernmaterie, Ablösung des Karyolemmas;
• das Vorhandensein sogenannter „Lochkerne“, wenn vom Zellkern nur ein Karyolemma übrig bleibt;
• das Vorhandensein intranukleärer Einschlüsse - Cowdry-Körper.

Bei der Durchführung einer PIF erhält der Arzt nicht nur eine qualitative, sondern auch eine quantitative Bewertung des Zustands der infizierten Zellen, die wir zur Beurteilung der Wirksamkeit der antiviralen Therapie mit Aciclovir (AC) verwendet haben. So wurden 80 Patienten mit Herpes genitalis simplex (GH) mithilfe der PIF-Methode dynamisch untersucht. Es zeigte sich, dass vor der Behandlung mit Aciclovir 88 % der Patienten einen hohen Prozentsatz infizierter Zellen (50 – 75 % und mehr) in den Abstrichen aufwiesen, nach einer Aciclovir-Behandlung jedoch bei 44 % der Patienten in den Abstrichen gesunde Zellen nachgewiesen wurden, in 31 % der Fälle einzelne infizierte Zellen festgestellt wurden und bei 25 % der Patienten bis zu 10 % infizierte Zellen vorlagen.

Gehalt infizierter Zellen in Abstrichen (PIF-Reaktion) von Patienten mit Genitalherpes, die mit Aciclovir behandelt wurden

Krankheitsperioden	Prozentualer Gehalt in Ausstrichen
	Infizierte Zellen					Normale Zellen
	Mehr als 75 %	50-75%	40-50%	10 %	Einzelne Zellen im Sichtfeld
Rückfall (vor der Behandlung)	25 %	63 %	12%
	(20)	(50)	(10)
Remission (nach der Behandlung)				25 %	31 %	44 %
				(20)	(25)	(35)

Bei der langjährigen Verwendung von PIF und der Punkthybridisierungsmethode wurde festgestellt, dass die Ergebnisse der Studie in fast 100 % der Fälle übereinstimmen. Es ist zu beachten, dass zur Erhöhung der Zuverlässigkeit der Herpesdiagnose, insbesondere bei subklinischen und niedrig manifesten Formen von Herpes, empfohlen wird, 2-3 Methoden der Labordiagnostik in der Arbeit anzuwenden, insbesondere bei der Untersuchung von Schwangeren, Frauen mit ungünstiger Geburtsanamnese und Personen mit einer nicht näher bezeichneten gynäkologischen Diagnose.

Daher ist es bei der PCR-Diagnostik viraler und bakterieller Infektionen des Urogenitaltrakts erforderlich, die erhaltenen positiven Ergebnisse unter Berücksichtigung der Anamnese und des Vorhandenseins (oder Fehlens) spezifischer klinischer Symptome der Krankheit zu bewerten. Wenn Chlamydien mittels PCR nachgewiesen werden, ist die Wahrscheinlichkeit einer Infektion hoch und die Therapiefragen können entsprechend geklärt werden. Beim Nachweis von Mykoplasmen (Ureaplasmen), bei denen es sich um opportunistische Mikroorganismen handelt, sind zur Bestätigung der Diagnose zusätzliche kulturelle Untersuchungen erforderlich, d. h. die Aussaat von Material des Patienten auf empfindliche Zellkulturen. Nur wenn die kulturelle Analyse positive Ergebnisse liefert, können wir von einer Laborbestätigung der Diagnose Mykoplasmose sprechen. Mit derselben Methode lässt sich bei Bedarf die Empfindlichkeit der isolierten Mykoplasmen gegenüber häufig verwendeten Darreichungsformen (Antibiotika, Fluorchinolone usw.) bestimmen.

Eine gleichzeitige Infektion mit mehreren Viren der Familie Herpesviridae ist möglich. Wir stellten häufig eine Infektion eines Patienten mit HSV-1-, HSV-2- und CMV-Viren fest. Patienten mit klinischen und laborchemischen Manifestationen eines sekundären IDS (onkohämatologische, onkologische, HIV-infizierte Patienten) waren signifikant häufiger mit mehreren Herpesviren infiziert. So wurde gezeigt, dass klinische und immunologische Störungen, die bei einer HIV-Infektion fortschreiten, mit einem Anstieg der Anzahl der durch die molekulare Hybridisierungsmethode nachgewiesenen Herpesviren einhergehen. In diesem Fall kann der komplexe gleichzeitige Nachweis von DNA vom Typ HSV-1, CMV und HHV-6 als prognostisch am aussagekräftigsten angesehen werden.

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