Embryonale Stammzellen

Die Entdeckung von embryonaler Stammzellen - es war kein Zufall, und erschien auf der vorbereitete Bodenforschung auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie Forschung. Der Begriff „Stammzelle“ wurde an der Society of Hematology Congress in Berlin, Alexander Maximov auf hämatopoetischen Zellen angewandt 1908 in der Medizin eingeführt. Lange bevor die Isolierung und Herstellung von stabilen Linien von pluripotenten embryonalen Stammzellen in der frühen Entwicklung des Forschungsprozesses verwendeten Stamm terato- (embryo-Karzinomzellen, mit denen den unbekannten Mechanismen der Embryonalentwicklung untersucht, einschließlich der Sequenz der Expression der frühen Gene und die Proteinprodukte ihrer Arbeit.

Aber ist die Totipotenz des menschlichen Genoms im Laufe der Evolution irreparabel verloren? Nein, und Embryogenese ist der Beweis. Wenn dem so ist, wenn dann im Prinzip der zweite Weg der evolutionären Entwicklung verwirklicht wird? Wahrscheinlich, wenn eine Person den Kosmos verlässt, wo die Umweltbedingungen für eine relativ lange Zeit relativ konstant sein werden. Knochenschwund (Knochenentmineralisierung in Schwerelosigkeit) sehr langsam zugänglich Umbau und die Regeneration können als ersten Schritt für den menschlichen Anpassungsprozess als eine Art von Existenz im Raum betrachtet werden. Allerdings wird die Gebühr für den zweiten Weg der evolutionären Entwicklung unterschiedlich sein - für die Rückkehr aller Zellen der Totipotenz und absoluten Plastizität zu zahlen steril zu sein. So multiplizieren in dieser Welt der "evolutionären Chamäleons" wird keine Meiose haben, otpochkovaniem. Aber wir werden lange leben. Die Unsterblichkeit der Telomerase ist die Unsterblichkeit der Amöbe. In einem vielzelligen Organismus sind die Stammzellen das Substrat quantitativer und qualitativer Langlebigkeit.

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Quellen von embryonalen Stammzellen

Heute Quellen embryonaler Stammzellen für Laboruntersuchungen sind Linien murine Teratokarzinom (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, RL, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) und humane Teratokarzinom (NTera-2, TERA-2 , H-9-Klon) sowie HESS Trauneona. Allerdings detailliert die Anwesenheit zellulären Pass Immun Phänotyp anzeigt, Chromosomenanalyse Ergebnisse der mRNA-Expressionsprofile ausgesetzt Rezeptoren und intrazellulären Protein-Signalisierung nicht für erhebliche Nachteile kompensieren teratokartsinomnyh Linien ESC - schnellen Verlust der Totipotenz und Unmöglichkeit der Anwendung in den klinischen Studien und gemischte Differenzierung in Kultur sehr schwer zu isolieren reine spezialisierte Linie aus einer heterogenen Zellpopulation. Daher, in der Regel einer Quelle ESC Linien für klinische Zwecke hergestellt, dient als die innere Zellmasse des Blastozysten, Embryonen einzelne Blastomeren von 8-Zellen-Stadium der Entwicklung, Morula-Zellen spätere Stadien und primäre Keimzelle.

Es ist anzumerken, dass Teratokarzinomzellen, obwohl sie pluripotent sind, ein signifikant niedrigeres pluripotentes Potenzial im Vergleich zu ESC aufweisen. Ihre Integration in embryonale Zellen führt selten zur Bildung von Chimären, in denen sich auch keine Gameten mit einem Genotyp von Teratokarzinomzellen bilden. Es wird angenommen, dass dies auf das häufige Auftreten von Chromosomenanomalien bei der Kultivierung von Teratocarcinzellen zurückzuführen ist: Verlust des Y-Chromosoms, verschiedene Trisomien, Deletionen oder Translokationen.

Versuche, die menschliche ESC-Linie zu unterscheiden, wurden viele Male unternommen, aber diese Aufgabe konnte nicht gelöst werden, da normale menschliche Blastozysten schwierig zu erreichende Objekte sind. Beim Menschen ist die Häufigkeit von Chromosomenanomalien höher als bei der Embryogenese von Tieren. Die überwiegende Mehrheit der frühen menschlichen Embryonen, die nach der In-vitro-Fertilisation erhalten wurden, zeigen chaotische chromosomale Mosaike und oft gibt es numerische und strukturelle Abweichungen. Noch später, im Blastozystenstadium, bestehen nur 20-25% der menschlichen Embryonen aus Zellen mit einem normalen Karyotyp. Es war fast unmöglich, solche Embryonen zu verwenden, um ein ESC zu erzeugen, da Zygoten normalerweise in zwei oder vier Blastomeren kultiviert und dann in den Uterus transplantiert wurden. Erst vor relativ kurzer Zeit wurde eine zuverlässige Technik zur Kultivierung von befruchteten menschlichen Ovula bis zum Blastozystenstadium entwickelt. Die Einführung dieser Technik in die Praxis der In-vitro-Fertilisation erhöhte nicht nur die Häufigkeit erfolgreicher Implantationsergebnisse, sondern machte auch normale Blastozysten zu einem zugänglicheren Objekt.

Eine andere pluripotente Stammzellquelle sind die primären Geschlechtszellen, die im Gegensatz zu den weiter fortgeschrittenen Vorläuferpopulationen Epithels germenativnogo, sind nicht auf die Oberfläche des beta-Integrin, aber eine hohe Aktivität shelochnoy Phosphatase exprimieren. Es sei darauf hingewiesen, dass in dem Experiment die Population von Stammzellen, die aus primären Geschlechtszellen gebildet wurden, seit den 80er Jahren des letzten Jahrhunderts untersucht wurde. Zur gleichen Zeit wurde eine Technik zur Isolierung von primären Keimzellen aus dem Rudiment der Maus-Embryo-Gonade entwickelt. Die ersten erfolglosen Ergebnisse der Kultivierung primärer Keimzellen in vitro legten die Hoffnungslosigkeit dieser Versuche nahe, da die Zellen, obwohl sie überlebten, nicht wuchsen und innerhalb der ersten 24 Stunden starben. Später wurde gefunden, dass sich primäre Mauskeimzellen in vitro nur in Gegenwart von löslichen und membrangebundenen spezifischen Polypeptidwachstumsfaktoren im Kulturmedium vermehren. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass es die Anwesenheit in dem Kulturmedium nicht nur LIF, aber membrannosvyazannyh und Stahl-löslichen Faktor (SIF) für das Überleben und die Proliferation von primordialen Keimzellen notwendig ist. Diese Peptide werden von somatischen Zellen von Embryos erzeugt, die für die Steel-Mutation homozygot sind, und eines von ihnen ist ein Ligand des Proto-Onkogens cKit.

Primäre Keimzellen von Säugetieren und Menschen sind extragonadalen Ursprungs und die Quelle der klonalen Entwicklung der Geschlechtszelllinie. Startlinie Zellen primordiale Keime sowie alle Gewebe des Embryos und extraembryonic Mesoderm gibt Epiblasten (primäre Ektoderm) frühe Embryonen Mosaik strukturelle Organisation mit. Die mikrochirurgische Entfernung von verschiedenen Teilen des frühen Embryos etablierte eine Lokalisationszone im Epiblast eines Klons von festgelegten Vorläufern primärer Keimzellen. Mit rodamindekstrana, die als Zellmarker verwendet wurde festgestellt, dass Vorläufer Urkeimzellen im proximalen Bereich des Epiblasten befinden, in der Nähe des extraembryonic Ektoderm. Die primäre sexuelle Zelllinie geht aus dem 45-Zell-Klon hervor, dessen Zuordnung zu Beginn der Gastrulation erfolgt. Dann tritt die Klonsegregation auf, und während der Gastrulation treten die primären Geschlechtszellen in das extraembryonale Mesoderm ein und sind in der Basis der Allantoisknospe hinter der primären Bande zu finden. Von dort wandern die primären Keimzellen zum ventralen Ende des Endocervix-Endoderms und bewegen sich dann aktiv am Mesenterium entlang, wobei sie am Ende der Migration die Genitalwalzen bevölkern. Während des Migrationsprozesses sowie in den ersten 2-3 Tagen der Lokalisation im Gonaden-Rudiment proliferieren die primären Geschlechtszellen aktiv und durchlaufen acht Replikationszyklen. Wenn zu Beginn der Migration etwa 50 primäre Keimzellen vorhanden sind, dann übersteigt in den Reproduktionszysten von Mausembryonen der Zwölf-Tage-Entwicklung die Anzahl der primären Geschlechtszellen 25.000.

Die funktionelle Ähnlichkeit von WSR und Urkeimzellen zeigt die vollständige Integration der letzteren in der Ersatz-Blastozyste innere Zellmasse und anschließende vollständige Entwicklung des Embryos, Gewebe, das nur aus Nachkommen Urkeimzellen bestehen. Gemäß weiteren Merkmalen murine primären PGCs Keimzellen waren ebenfalls identisch, die Fähigkeit, in verschiedene Richtungen zu unterscheiden, zeigt, embryoid bodies in vitro zu bilden, wird eine in-vivo-Form Teratome, wenn sie subkutan in immundefiziente Mäuse ähnelt spontane Teratome testis Mäuse Linie 129 / ter injiziert.

Es wird festgestellt, dass, wenn sie auf LIF Medium gegeben und lösliche membrannosvyazannogo SIF primäre Keimzellen von 8-Tag isoliert murine Embryonen überleben und für 4 Tage in Kultur vermehren, aber dann sterben. Außerdem, wenn die Periode die Kultur des Todes zusammenfällt mit der Phase der Entwicklung der Maus-Embryonen (12,5-13,5 Tage), wenn die Knospen primäre gonadalen weibliche Keimzellen Meiose ein und in den männlichen primordialen Keimzellen Urkeimzellen beobachtet mitotischen blockiert sind Teilung. Wenn Sie jedoch auf die Umwelt nicht nur das Wachstum hinzufügen Faktoren LIF und den SIF, sondern auch von FGF2, die primären Keimzellen weiter proliferirovat und Subkulturen sind Zellkolonien gebildet selbst nach (SIF und FGF) aus der Umgebung von Wachstumsfaktoren entfernt wurde reproduzieren können. Solche Zellen können für lange Zeit auf dem embryonalen Fibroblastensubstrat ohne die Zugabe von löslichem Wachstumsfaktor LIF kultiviert werden. Es sind diese stabilen Zelllinien, die von primären Keimzellen stammen, von denen man annimmt, dass sie embryonale Keimzellen genannt werden. Dieser Begriff ist nicht erfolgreich, da in Betracht gezogen werden, wenn kultivierte EG-Zellen können nicht embryonale Keimzellen erhalten werden, der fähig ist auf die Durchführung der nachfolgenden Stufen oder der Oogenese Spermatogenese aus. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass die EG-Zelllinien, obwohl aus primordialen Keimzellen abgeleitet, aber in der Kultur der Eigenschaften des embryonalen pluripotenten Stammzellen Erwerbs verlieren ihre Fähigkeit, die germenativnye Linie zu begehen. Mit anderen Worten, primäre Geschlechtszellen verlieren bei Kultivierung die Eigenschaften von Gametenvorläufern und werden in ESC-ähnliche pluripotente Zellen transformiert.

Es ist anzumerken, dass, wenn Immundefiziente EG-Mäuse verabreicht werden, Teratome nicht entstehen. Es wird angenommen, dass der Verlust der Fähigkeit humaner EG-Zellen, Teratome zu initiieren, auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass diese Linien nicht direkt aus kultivierten primären Keimzellen erzeugt wurden, sondern aus Zellen erhalten wurden, die aus embryonalen Körpern isoliert wurden. Daher ist es möglich, dass sie Nachkommen von pluripotenten, aber bereits engagierten Zellen sind.

Es sollte beachtet werden, dass zwischen EG-Zellen und primären Keimzellen grundlegende Unterschiede bestehen. Letztere ermöglichen es nicht, chimäre Mausembryonen zu erhalten, was auf die fehlende Fähigkeit primärer Keimzellen zur Integration in die innere Zellmasse oder Trophektoderm hinweist. Die Merkmale der Population primärer Geschlechtszellen ähneln eher den festgelegten Linien somatischer Zellen späterer Embryonen, deren Einführung in die Blastozyste auch nicht zur Bildung chimärer Embryonen führt.

Modifikationstechniken, die Embryoidkörpern mit EG-Aggregation der Zellen durch Selektion auf Selektionsmedien erlaubt erhielten Kulti andere Population von pluripotenten Zellen zu erhalten „, Zellen von embryoid bodies (- EBD-Zellen Embryoidkörper abgeleiteten Zellen) abgeleitet genannt. Die Fähigkeit von EBD-Zellen, sich für eine lange Zeit in der Kultur zu vermehren, erlaubte es, stabile Zelllinien von engagierten Zellen zu erzeugen. Klone von Zellen, die ein breites Spektrum von mRNA- und Proteinmarkern von spezialisierten Zellen exprimieren, wurden erhalten. Dieser Ansatz als Folge bewiesen, dass die primäre Geschlecht humanen pluripotenten Zellen und in vitro in verschiedene Zelltypen differenzieren: Neuronen, Glia, vaskulären Endothel, hämatopoetischen Zellen, Muskeln und Entodermzellen.

Alternative Quellen für embryonale Stammzellen

Alternative Quellen menschlicher ESC-Linien können Hybridzellen sein. Implantation in den Uterus von scheinschwangeren cows geterogenomnoy Struktur erhalten wird, wenn mittels Elektroporation fetusa menschlichen somatischen Zellen mit dem Ei cows verschmelzenden, die aus den Vorkern entfernt worden waren, ermöglicht es, die innere Zellmasse von Präimplantationsembryo künstlicher Entwicklungsstadien zu erhalten. Dazu wird in der ersten Stufe die Blastozyste aus dem Ei der Kuh mit dem transplantierten Kern der menschlichen Zelle gewonnen.

In der zweiten Stufe wird der Embryoblast aus der Blastozyste extrahiert und daraus - der ESC nach der Thomson-Methode. Es ist bemerkenswert, dass die besten Ergebnisse bei der Isolierung von ESC-Linien unter Verwendung dieser Methode erhalten wurden, indem Kerne von follikulären Zellen oder primären Keimzellen verwendet wurden, die im menschlichen Körper in einem Zustand des Winterschlafs bestehen. Dies ist aufgrund der Tatsache, daß eine Kuh Ei menschlicher Zellen Nukleus neukorochennye transplantierten sollte eine hohe Aktivität und telomere telomeazy hat, die vorzeitige Altern ESC-Klone, abgeleitet von Hybrid Ei (Repin, 2001) vermeidet. Es ist bekannt, dass die wichtigsten intrazellulären Marker-EGF-Proteine Oct3, Oct4, Tcf, Groucho sind, die zu den sogenannten Chromatin-Silencer-Proteinen gehören. Schalldämpfer bieten eine besonders kompakte Packung von Heterochromatin, die die Bildung von Euchromatin-Schleifen verhindert. Das von diesen Proteinen vermittelte Chromatinpaket korreliert mit der Totipotenz des ESC-Genoms. Bis heute wurde festgestellt, dass reife Ovula von Rindern und Menschen die einzige Art von spezialisierten Zellen sind, die hohe Konzentrationen von Schalldämpferproteinen im Cytoplasma enthalten. Auf dieser Basis wurde eine Methode zur Herstellung von hybriden ESCs entwickelt, bei der somatische Zellkerne in nichtnukleare Eizellen von Kühen übertragen werden. Vorläufige In-vitro-Studien haben gezeigt, dass das Cytoplasma der Eizellen von Kühen in 12-24 Stunden Kultivierung die Totipotenz des menschlichen somatischen Zellkerngenoms wiederherstellt.

Von besonderem Interesse sind Daten über die Merkmale der Präimplantationsentwicklung von menschlichen Embryonen, die einen späteren Ersatz von totipotenten Zellen durch eine Population von pluripotenten Zellen als bei Mäusen anzeigen. Die Untersuchung von Zelltransformationen zeigte, dass Zellen der inneren Zellmasse der menschlichen Blastozyste zusätzlich zu ESCs auch Trophoblastzellen erzeugen, was ihre Gesamtpotenz anzeigt.

Es ist bekannt, dass es im Stadium der Blastozyste zwei unterschiedlich motivierte Zellpopulationen gibt. Eine davon ist die äußere Schicht der Blastozyste, Trofectoderm, die aus Trophoblastzellen und anderen Komponenten der embryonalen Plazenta stammt. Die zweite Zellpopulation ist in eine dichte Masse gruppiert, die die innere Oberfläche des Trophektoderms berührt. Die Zellpopulation der inneren Zellmasse stammt von allen Geweben und Keimen der Embryoorgane. Im Stadium der späten Blastozyste wird ein extraembryonales Endoderm aus der inneren Zellmasse gebildet und ein Epiblast gebildet (das primäre Ektoderm). Gleichzeitig behalten Epiblastzellen ihre Pluripotenz bei, während die Fähigkeit zur Differenzierung von Zellen des extra-germinalen Endoderms begrenzt ist.

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Erhalten von humanen embryonalen Stammzellen

Bis vor kurzem wurde geglaubt, dass es unmöglich war, einen ESC vom Trophoblasten zu erhalten. Jedoch diploides Linie Trophektoderm Stammzellen aus Blastozysten isoliert in einem Medium, das anstelle von LIF und FGF2 Heparin enthält, proliferiert und in Stammzellen transformiert. Wenn Sie aus der Mitte FGF2 entfernen, stoppen die Trophektoderm Zellen züchten, beginnen sie Endoreduplikation von Chromosomen und Zellelemente trofektodermalnye in eine riesige Trophoblastzellen allmählich verwandelt. Wahrscheinlich hat LIF nicht die Proliferation von Trophektoderm Zellen aufgrund der Tatsache, dass stimulieren FGF2 einen Mechanismus transsignalizatsii als FGF2 löst die Bindung an zytoplasmatische Rezeptor (FGFR2-), aktivieren Sie die MAP-Kinase im Zytoplasma - ERK1 und ERK2. Folglich wird, wenn in die Zellen der Blastozyste eines Signalstoff-Stoffwechselweg integriert (LIF - gpl30 - JAK-Kinase - STAT3) innere Zellmasse-Zellen transformiert werden in pluripotenten hESCs, während den zweiten Mechanismus der Transmembran-Signalisierung Aktivieren (FGF2 - FGFR2 - MAP-Kinasen ERK1 / ERK2) In der Blastozyste bilden sich Stammzellen des Trophectoderms. Die Wahl des Signalwegs hängt wiederum von der Aktivität des oct4-Gens ab. Dieses Gen gehör POU Domäne, an der Stelle befand t 17 Autosomen und wird in Brechperiode als auch in Zellen der inneren Zellmasse des Blastozysten und in primordialen Keimzellen während des Oogenese, ausgedrückt. Funktionelles Rolle Oct4-Gen, kodierend einen Transkriptionsfaktor, die für das Auftreten von pluripotenten Zellen, die Differenzierung und Dedifferenzierung.

Die Expression des oct4-Gens im ESC variiert in Abhängigkeit von der Wechselwirkung dieses Transkriptionsfaktors mit den Cofaktoren. Eine gerichtete Regulation der oct4-Expression in Blastozysten zeigte, dass bei abnehmender Aktivität die Hälfte der Zellen ein Trophektoderm bildet, während bei einer Erhöhung der induzierten Expression von oct4 vorwiegend ESC auftritt.

In dem Experiment kann ESC nicht in eine Linie umgewandelt werden, wenn totipotente Blastomere in der Phase der Zerkleinerung kultiviert werden, sowie in dem Stadium der Gastrulation und späteren Stadien der Embryonalentwicklung. Maus-ESCs werden normalerweise am 3.5-4.5. Schwangerschaftstag zugeteilt, was der sechsten (einschichtige Blastozyste) und der siebten Stufe (einer zweischichtigen Blastozyste - einem frühen Eizylinder) der normalen Embryogenese entspricht. Offensichtlich enthalten Mäuseembryonen nur in der Präimplantationszeit Zellpopulationen, die in ESC umgewandelt werden können. Folglich ist die Isolation von ESC-Linien nur in bestimmten Stadien der Embryogenese möglich. Totipotent, unter dem Gesichtspunkt der Möglichkeit, einen lebensfähigen Embryo mit embryonalen Membranen und der Plazenta zu entwickeln, sind die Zygote und die Blastomere, die während der Zerkleinerung entstehen. Der Verlust der Gesamtwirksamkeit der Keimzellen beginnt im späten Morula-Stadium, wenn die weitere Blastomerenzerkleinerung von ihrem Standort abhängt. Frühe Morula-Blaetomere behalten ihre Totipotenz bei, da experimentelle Manipulationen mit Änderungen ihrer Position, beispielsweise eine Inversion ihrer Position, die Entwicklung eines vollen Embryos nicht verhindern.

Es wurde gefunden, dass die Effizienz der Freisetzung von ESC in der Linie durch den Zustand der Blastozysten zum Zeitpunkt ihrer Explantation beeinflusst wird. Die Verwendung von Blastozysten nach der Modellierung einer Sieben-Tage-Diapause im Genitaltrakt von Mäusen, die am 3.5. Tag der Schwangerschaft ovariektomiert wurden und Progesteron erhalten, fördert eine erfolgreichere Zuordnung von embryonalen Stammzelllinien. Es wird angenommen, dass unter solchen Bedingungen die Zahl der Blastomeren, die die innere Zellmasse bilden, zunimmt. Es ist auch möglich, dass sich der Zellzyklus ausdehnt und die meisten Blastomere in die G0-Phase eintreten.

Darüber hinaus hängt die Schaffung von stabilen pluripotenten hES Linien auf den Genotyp Embryonen: relativ leicht von WSR Murine Blastocysten Leitung 129 ist deutlich schwieriger, sie zu erhalten Mäuse CS7BL / 6 und praktisch unmöglich, unter Verwendung der Linie von hESCs Blastozysten CBA / Ca-Mäusen zu isolieren. Offensichtlich besitzen frühe Embryonen einige genetische Merkmale, die die Entwicklung der pluripotenten ESC-Linie beeinflussen. Wenn jedoch kultiviert Epiblasten isoliert, sowie durch die selektive Auswahl Differenzierung hES-Zelllinie aus frühen Embryonen CBA / Ca-Mäusen wurden noch zugeordnet.

Eine bewährte Standardtechnik zur Gewinnung von ESK-Linien aus Blastozysten ist in Laborhandbüchern zur Versuchstechnik mit frühen Embryonen gegeben. Experimentelle ESK-Linien können auch durch Kultivieren eines isolierten Epiblasts (primäres Ektoderm) von 4,5-Tage-Mausembryos mit einer ziemlich komplexen mikrochirurgischen Technik und modifizierten Kultivierungsbedingungen erhalten werden. Die Komplexität dieses Verfahrens ist gerechtfertigt, da die Häufigkeit der Bildung von ESC-Linien viel höher war als bei der Arbeit mit der inneren Zellmasse der Blastozyste.

Um die ESC-Linien zu isolieren, wird jeder Klon in eine Mikrovertiefung überführt, ein Aggregat von 40-60 Zellen wird gezüchtet, es wird erneut dispergiert. Die mehrfache Wiederholung dieses Verfahrens ermöglicht es, eine immortalisierte ESC-Linie mit einer maximalen Proliferationsrate von an den Kunststoff gebundenen normokaryotischen Zellen zu erhalten, die über 50 bis 100 Passagen Totipotenz und hohe Telomerase-Aktivität beibehalten. Bei der Unterstützung von ESC-Linien ist die Verschmutzung der Umwelt oder des Serums durch bakterielle Endotoxine am gefährlichsten - selbst Spurenkonzentrationen von Endotoxin im Kulturmedium verursachen den massiven Tod von unreifen Keimzellen. Mit einem sorgfältigen Kontrolle des linearen Wachstums und der rechtzeitigen Dispersion von WSR in Kultur fähig sind, symmetrischer Spaltung, in dem beide Tochterzellen bleiben pluripotent und kann eine unbegrenzte Anzahl von Zellzyklen durchzuführen, einen diploiden Karyotyp und die Gesamtwirkungsstärke beibehalten wird.

Die Selektion einer sauberen Population von menschlichen ESCs kann durchgeführt werden, nachdem rekombinante DNA-Moleküle, die ein Gen enthalten, das für die Synthese eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) kodiert, in ihr Genom transfiziert werden. Die GFP-Expression steigt mit dem Wachstum von ESC unter Bedingungen, die ihre Proliferation unterstützen, wohingegen mit dem Beginn der Differenzierung das Expressionsniveau dieses Gens reduziert wird, was die Selektion von reinen stabilen pluripotenten Zelllinien auf einem selektiven Medium erlaubt. Wenn sie mit GFP-Selektion von ESCs kultiviert werden, ist die Häufigkeit von Kolonien stark erhöht, da unter den Bedingungen von Selektionspflanzen die starke antiproliferative Wirkung differenzierter Zellen eliminiert wird.

Übersetzung von humanen embryonalen Stammzellen in Linie durch ihre Verfahren zur Isolierung von Präimplantationsembryonen (Schritt 80-120 Zellen), die nach den in-vitro-Fertilisation Verfahren bleiben. Dazu werden die künstlich gewonnenen "überschüssigen" Embryonen in der Delbecco-Nadel-Umgebung mechanisch dispergiert. Nachdem die Zellen mit selektiven monoklonalen Antikörpern mit einer Fluoreszenzmarkierung markiert worden sind, werden die Zellen des Embryoblasten isoliert. Der Embryoblast wird in einzelne Zellen unter Verwendung einer Mischung von Disaspase-Kollagenase dispergiert. Dissoziierte Zellen wurden in einem speziellen Medium (80% Delbekko Medium + 20% fetales Kälberserum in Gegenwart von 500 & mgr; g / ml von IL-6, LIF und SCF) auf der Monoschicht aus embryonalen Fibroblasten Fadenzuführer 3 erste Passagen gezüchtet. In diesem Fall wird das Überleben und die Proliferation von Stamm- und Vorläuferzellen durch Exposition gegenüber IL-6, LIF und SCF unterstützt. In einer solchen Umgebung wachsen die ESCs durch Suspensionsklone von nicht angehefteten abgekratzten Zellen, die durch sanftes mehrfaches Pipettieren dissoziiert werden müssen. Neue Klone erscheinen am 5.-7. Tag in der suspendierten Kultur. Die maximale Wachstumsrate von ESC wird durch wiederholte Dissoziation von Klonen im Stadium von 10-15 Zellen erreicht. Dann wird jeder Klon in eine Mikrozelle übertragen und zu einem Aggregat von 40 bis 50 Zellen gezüchtet. Das Verfahren wird viele Male in Passagen wiederholt, wobei das Kulturvolumen auf eine Dichte von 5-10 Millionen Zellen pro 6 cm-Becher erhöht wird. Durch Verwendung eines solchen Thomson Passagierung es 10 Klone unsterbliche menschliche WSR isoliert wurde, die durch die Durchlässe 100 hohe Telomerase-Aktivität beibehalten, die Fähigkeit zu intensiven Proliferation und phänotypischen Eigenschaften minimale Gesamt Potenz, mit der Differenzierung in jedem der 350 spezialisierten Zelllinien, die abgeleitet sind Ekto-, Meso- - und Endoderm. Differenzierung von humanen ESC gestartet (bei Wechsel des Mediums, Addition und Eliminierung von LIF Serum) mit Zellanheftung an dem Substrat, um die Entwicklung des Zytoskeletts und die Expression von Adhäsionsrezeptoren anzeigt. Es ist wichtig, dass bei uneingeschränkter Proliferation von menschlichen ESCs ein normaler Karyotyp erhalten bleibt.

Die zweite Methode zur Isolierung menschlicher ESC-Linien basiert auf der Verwendung primärer Geschlechtszellen. Experimentelle Studien haben gezeigt, dass Eu-Zelllinien aus den Genitalplaques von 12,5 Tage alten Embryonen von Mäusen erhalten werden können. In diesen Fällen war die Häufigkeit der Bildung der Vorläuferzelllinien jedoch signifikant geringer als in Experimenten mit früheren Embryonen. Zur gleichen Zeit sind primäre Geschlechtszellen von Gonaden von Mausembryonen mit einem Gestationsalter von 13,5 Tagen im allgemeinen nicht in der Lage, sich in Linien zu verwandeln.

Die ersten stabilen Linien von humanen pluripotenten EG-Zellen wurden aus primären gonocytes von Genital primordia 5-9 Wochen alten Embryonen isoliert abgeleitet. Isolierte Zellen wurden auf einem Substrat aus inaktivierten embryonalen Maus-Fibroblasten in DMEM-Medium mit fötalem Serum kultiviert und es wurde Mercaptoethanol, Forskolin sowie rekombinante menschliche Wachstumsfaktoren (FGF und LIF) zugegeben. Nach 7-12 Tagen erschienen multizelluläre Kolonien in Kultur, entsprechend morphologischen Merkmalen und molekularen Markern, die humanen EG-Zellen entsprechen. Nach der Aggregation bildeten diese Zellen embryoid bodies, mit deren Weiterentwicklung spezialisierte Zellen entstanden, die für die Derivate aller drei embryonalen Blätter charakteristisch sind. Während 10-20 Durchgängen behielten die EG-Zelllinien den normalen Karyotyp bei und verloren keine Pluripotenz.

Es wird auch gezeigt, dass die kombinierte Wirkung von LIF, membrangebundenen und löslichen Stahlfaktoren sowie TGF-b das Programm für die Entwicklung von primären Keimzellen modifiziert. Anstatt die mitotischen Trennungen zu stoppen und zu beginnen, sich in Richtung Oogenese oder Spermatogenese zu differenzieren, vermehren sich die primären Geschlechtszellen weiter. Nach einigen zusätzlichen mitotischen Zyklen werden sie den Epiblastzellen ähnlich und werden, wenn sie die Eigenschaften von Vorläufern von Keimzellen verlieren, in pluripotente embryonale Stamm-EG-Zellen transformiert.

So wurden 1998 unsterblich gemachte Reihen primärer Geschlechtszellen zuerst aus dem sexuellen Rudiment des menschlichen fötalen Autopsiegewebes isoliert. Die Embryonalentwicklung von humanen primären Keimzellen erscheint in dem Dottersack in der dritten Woche der Entwicklung, und auf den 4./5 Wochen wandern diese Zellen in den Bereich der sexuellen Tuberkel, wo sie eine Bevölkerung von primärem dormantnye gonocytes bilden. Im inaktiven Zustand bleiben primäre Keimzellen bis zur Geburt im Keim. Primäre Keimzelllinien wurden aus den fötalen Genitalhöcker extrahieren 5-9 Wochen alten Embryonen ex tempore Stoff abgerufen, die mit einem Gemisch aus Kollagenase Typ IV-V, Hyaluronidase und DNAse für quantitative und qualitative Steigerung der Zellausbeute behandelt wird. Primäre Keimzellen in den Geweben des fötalen Genitalhöckers sind von Sertoli-Stroma- (Mesenchym-) Zellen umgeben. Funktionelles Zweck der Sertoli-Zellen ist die Produktion von anti-apoptotischen Faktoren (Fas-Ligand), Mitogene und Immunsuppressiva, die sexuellen Stammzellen aus Immunangriff durch den Körper zu schützen. Darüber hinaus spielt die stromale Mikroumgebung des Tuberculum genitalis eine wichtige Rolle bei der Reifung der Gameten. Die isolierten primären Keimzellen werden in die Kultur über die stromale Nahrungsschicht, die aus den fötalen Fibroblasten der ersten drei Passagen besteht, eingepflanzt. Die effektivste Kombination von Mitogenen ist ein Komplex bestehend aus LIF, FGF und Forskolin (ein Stimulans für die Bildung von cAMP). Proliferation Urkeimzellen in vitro erfordern die Zugabe von fötalem Serum, in Gegenwart eines primären Reproduktion gonocytes in Kultur durch die Bildung von kugeligen, nicht-adhärente Zellen mit dem Substrat begleitet Klone.

Die US National Institutes of Health auf der Grundlage der Zusammenfassung vorhandene Informationen über die Methoden der Zuweisung von Human ESC Linien aus Blastozysten wurde eine vorläufige Schlussfolgerung, dass die erfolgreiche Zuordnung des ESC ist höchstwahrscheinlich gemacht, wenn kultiviert Blastozysten mit gut ausgebildeten innerer Zellmasse (Stammzellen: wissenschaftliche Fortschritte und zukünftige Forschungsrichtungen Nat. Inst, der Gesundheit USA). Aus dieser Sicht auf die beste Quelle für WSR zu schaffen Linien menschlicher Blastozyste 5. Tag der Entwicklung sind, von denen die Zuordnung der inneren Zellmasse sollte sorgfältig Trophektoderm entfernen werden. Isolierte innere Zellmasse in diesem Stadium von 30-35 Zellen bestehend muß auf einem Substrat murine embryonale Fibroblasten kultiviert werden, die eine entscheidende Voraussetzung für die Bildung von Kolonien in Kultur hESCs ist.

Die Analyse der phänotypischen Merkmale von embryonalen Stammzellen

Definite Interesse zwischenartliche vergleichende Analyse der phänotypischen Merkmale des ESC. Es wurde festgestellt, dass die menschliche ESC Kolonien - ein dichter Cluster von abgeflachten Epithel-Zellen, während Mäuse embryoide Kalb bestehen aus losem Konglomerat aus abgerundeten Zellen. In der menschlichen ESC-Index Kernplasmatischen Verhältnis niedriger als in der Maus WSR. Affe embryonale Stammzellen bilden flache Kolonien mehr gezackte Zellen. In den frühen Primaten WSR Klone leicht getrennten Zellen sichtbar. Wuchernden hESCs alle Arten von Tieren nicht MHC-Klasse-I und II exprimieren. Zur gleichen Zeit, geben menschliche WSR eine positive Antwort auf Antikörper TERA 1-60 und GCTM-2, das die Anwesenheit auf ihrer Oberfläche Keratin / Chondroitinsulfat-Proteoglycane, die charakteristisch für embryonale (Teratome) -kartsinomnyh Stammzellen anzeigt. Expression in hESCs alle Arten von Tieren oct4 Gen legt nahe, dass trotz der phänotypischen Unterschiede in Mensch und Maus WSR, offenbar durch den gleichen Satz von Genen aktiviert, die für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz (Peru, 2001). Darüber hinaus leiteten die ESC Linien von embryonalen Ratten, Schweine, Kaninchen, Primaten und Rinder, haben ähnliche morphologische Eigenschaften, eine ähnliche Reihe von molekularen Identifizierung von Markern und einem nahezu identischen molekularen Mechanismus für die Umsetzung des Embryonalentwicklung Programm, das Sie einen neuen Blick auf die Xenotransplantation Ausgabe nehmen können .

Im Gegensatz zu normalen Embryogenese in vivo, in vitro die Proliferation von hESCs wird nicht durch die Bildung von Keimschichten begleitet und geht homeotischen Nohgenov Hintergrund zu blockieren, das heißt, ohne dass der Organogenese. Da Segmentierungsgen funktionieren nicht in Kultur unmöglich hESCs solche Perioden der Embryonalentwicklung als Registerkarte somite Segmentierung des Kerns zu reproduzieren, die Bildung von Dottersack, Allantois provisory und anderen Organen und Geweben. Die Kultur-ESCs wurden zu Beginn der Bildung von 350 Restriktionslinien von spezialisierten Zellen eingefroren. Somit sind Zellen, Klon Tochtergesellschaft Vorläufer- und zentral lokalisierte PGCs nur Modell Embryo während der Entwicklung, in denen verschiedene Gewebebereiche in einer Stufe gebildet werden, unterscheiden sich von spezialisierten Zellen abgeleitet ist, jedoch von gemeinsamen Vorläufer. Obwohl das Mindestmaß an Rezeptoren auf der Oberfläche von hES, behalten sie die Fähigkeit primitive morphogenetischen Prozesse auszuführen, um den Großteil der frühen Embryo Struktur zu simulieren: Schlamm hESCs in Kultur und Aggregaten bildet eine Struktur Blastozyste ähnlich oder sogar später Embryonen (Ei Zylinder). Solche Suspensionsaggregate wurden entsprechend einfache und komplexe embryoide Körper genannt.

Wenn differenzieren sich in verschiedenen Zellen des Embryoidkörper gemischt gleichzeitig durch early genes Ektoderm (OCT3, FGF-5, nodal) ausgedrückt, Endoderm (GATA-4), Mesoderm (Brachyury), cardio Mesoderm (PKH-2,5), Neuralrohr (msx3 ) und Hämatopoese (Elkf). Mit verschiedenen Kombinationen von Zytokinen und Wachstumsfaktoren in einer Anzahl von Fällen die Bildung von Keimschichtzellen in vitro Targeting war es möglich, Embryoidkörpern zu erhalten, die vorzugsweise Gene Ektoderm oder Mesoderm exprimiert wurden, die den Weg für die Modellierung der Gastrulation und früher Organogenese Phase öffnet.

Klonwachstum von hES Beweise für asymmetrische Zellteilung ist, bei der nur eine der ESC im Zentrum Klon behält nicht einschränkende Fortpflanzungsfähigkeit, während die andere Tochterzelle Anstieg der Erzeugung von Vorläuferzellen gibt, die Differenzierung bereits kommt in. Daher ist die Vermehrungsrate des Klons an der Peripherie des embryonalen Körpers höher als in der Mitte. Die Randzellen des wachsenden Klons unterliegen einer spontanen Fehldifferenzierung, wandern ab oder sterben durch die Mechanismen der Apoptose. Diese Ereignisse das Schicksal des Klons bestimmen, ob die Proliferationsrate, die Rate der Migration und apoptotischen Zelltod übersteigt, Klon Größen weiter zu erhöhen, tritt Stabilisierung mit gleicher Apoptose und der Rate der Bildung neuer Zellgeschwindigkeit, Regression - das umgekehrten Verhältnis dieser Prozesse. Vorläuferzellen teilen sich symmetrisch, das heißt, beide Tochterzellen werden weiter zu reifen spezialisierten Zelllinien differenziert. Das Verhältnis von ESC / Vorläuferzellen variiert, aber immer ist die Menge an ESC nur ein Bruchteil eines Prozents der Vorläuferzellpopulation. Daher können nur sorgfältige Pipettierung und rechtzeitige Disaggregation von Klonen die Anzahl von ESCs in Kultur erhöhen. Um die maximale Ausbeute an ESC zu erhalten, war die Disaggregation der Klone im Stadium von 10-12 Zellen am effektivsten. Die Richtung und der Grad der Differenzierung von Zellen im embryonalen Körper hängt von ihrem Ort ab. Exterior Embryoidkörper Zellen exprimieren das Gen nicht und Oct4 laufen Differenzierung in primären Endoderm Zellen, aus denen anschließend Epitheloidzellen und parietalen extraembryonic viszeralen Endoderm gebildet. Die inneren Zellen des Embryoid-Körpers exprimieren das oct4-Gen und behalten die Pluripotenz für 48 Stunden Kultur bei. Dann aber tritt die morphologische Reorganisation im epithelialen einschichtigen Kultur beginnt und Expression von Genen, die die Entwicklung von primären Ektoderm steuern. Dann beginnt der Prozess der totalen gestörten Zytodifferenzierung mit dem Auftreten verschiedener Zelltypen, die die Ableitungen aller drei Keimblätter sind. Im Prozess der spontanen Differenzierung der Zellen Embryoidkörper ersten Aggregaten Endoderm Marker in Form von Fragmenten (Zysten) Dottersack entstehen. Darüber hinaus erscheinen Angioblasten und Endothelzellen von wachsenden Kapillaren in diesen Strukturen. In der Endphase der spontanen Differenzierung der internen Zellen des Embryoidkörper entwickelt verschiedene terminal differenzierten Zellen, einschließlich Neuronen, Glia-Elemente, Kardiomyozyten, Makrophagen und Erythrozyten. In bestimmten Approximation (unter Berücksichtigung der räumlichen Inversion von Blättern, die embryonales Gewebe bilden) über die embryoid bodies in vitro können morphogenetische Prozesse erforschen und die molekularen Mechanismen der embryonalen Zelldifferenzierung Anfangsperiode zu analysieren, und die Rolle spezifischer Gene, die in der Durchführung dieser Prozesse herzustellen.

Innerhalb des Klons befinden sich Zellen, in denen verschiedene genetische Entwicklungsprogramme entdeckt werden - ESCs, frühe Vorläuferzellen und differenzierende Vorläuferpopulationen. Die Kultivierung von ESC durch die Methoden eines herabhängenden Tropfens oder einer Massenkultur ohne eine Futterschicht und ohne den Zusatz von LIF in dem Medium führt unweigerlich zur Bildung von embryonalen Körpern. Die Morphologie der Zellen der äußeren und inneren Schichten der Embryoidkörper ist unterschiedlich. Die äußere Schicht besteht aus großen Prozesszellen. Ihre der Umwelt zugewandte Oberfläche ist mit zahlreichen Mikrovilli bedeckt. Die äußere Zellschicht ist von der inneren Basalmembran, die der Reichert-Membran ähnelt, getrennt, während die Zellen der inneren Schicht der embryonalen Körper ein zylindrisches Epithel sind. Morphologisch erinnert die innere Schicht, obwohl sie viele sich teilende Zellen enthält, eher an undifferenzierte ESC-Kolonien.

Eigenschaften von humanen embryonalen Stammzellen

Das Fehlen von parenchymal-mesenchymale Interaktionen auf dem Hintergrundsignal Gene blockieren Homöosis ungeordnetes Wachstum von PGCs in Kultur verursacht, da dieser Registerkarte gebrochen sind und die Bildung Infrastruktur provisory Organe. Unorganisiertes Wachstum und ungeordnete spontane Differenzierung von hES in Kultur wegen des Mangels an mesenchymalen Kennzeichnung Stromatumoren Rahmen künftiger Institutionen: in vitro ist es möglich, die Bildung von Millionen von Hepatozyten, aber man kann nicht alle Segmente der Leber erhalten, einschließlich solchen strukturellen und funktionellen Elemente, wie zum Beispiel der Nasennebenhöhlen, den Raum von Disse und Kupffer-Zellen.

Es wird angenommen, dass die Pluripotenz von WSR ausschließlich in der Embryonalentwicklung realisierte Gewebe und Organe des Embryos zu bilden, während die Nabelschnur und Plazenta Trophoblasten ableiten. Eingeschlossen in einer Hülle trofektodermalnuyu ESK durchweg Zellklone generieren provisory Entwicklungsprogramm durch kombinatorische mRNA bulk Nohteyaov topographische Matrix realisieren, die die räumliche Anordnung vorherzubestimmen, Form, Abmessungen, die Anzahl der vorläufigen und endgültigen Organzellen und Parenchym Montage in strukturellen und funktionellen Einheit. Zur gleichen Zeit sind die ESC der einzige Zelltyp, in dem der molekularen Mechanismus der Realisierung ihrer Potenziale vollständig aus dem genetischen Programm der Entwicklung und ESCOs mich von der Möglichkeit der Interaktion mit anderen Zellen zu einer Verstopfung Systeme beiden Rezeptoren Wahrnehmungen und transsignalizatsii aufgrund beraubt distanziert. Allerdings ist eine ausreichende Aktivierung WSR Ergebnisse in allmählichen Einsatz Embryonalentwicklung Programm Ende Geburt vollständig ausgebildet und bereit, extrauterine Leben eines Organismus aus Milliarden von Zellen zusammengesetzt. In dieser kurzen Zeit, aber unvorstellbar Schulden in den zellulären Raum Weg unvermeidlich Auftreten von Fehlern in den molekularen Mechanismen, die Vitalfunktionen von Zellen bereitzustellen, und in den Programmen, die ihre Proliferation, Differenzierung und Spezialisierung zu steuern. Daher werden in der modernen Pharmakogenomik die Krankheiten der molekularen Struktur und Zellprogrammierungserkrankungen getrennt betrachtet. Und die Wirkung der Mehrheit neuer Medikamente zur Förderung des Namen des Programms, der Differenzierung, Proliferation und Organogenese zu korrigieren, sowie die Regeneration von Organen und Geweben. Im erwachsenen Organismus über WSR wird es möglich, das Verhalten von Stammzellen / Vorläuferzellen in das Gehirn, Leber transplantiert zu kontrollieren, Milz, Knochenmark und anderen Organen des menschlichen einen beschädigten Empfänger parenchymatösen Organen aufgrund Differenzierung und Spezialisierung Spender mesenchymalen Zellen konserviert Matrix zu reparieren. Im Wesentlichen bringt Totipotenz Programm eine andere Eizelle Genomebene, Zygoten und Blastomeren, aber diese Zellen ist noch nicht möglich, in den Mengen zu klonen und agierten, die für die Bedürfnisse von experiental und praktischen Medizin. Daher ist der ESC eine einzigartige Quelle der genetischen Information der dreidimensionale lineare Restriktionskarte des Embryos und Codes von spezialisierten Zelllinien während der Gastrulation enthält.

Praktisch unbegrenzte Möglichkeiten der regenerative ESC aufgrund der Tatsache, dass ihr Genom, im Gegensatz zu dem genetischen Apparat der somatischen Zellen differenziert, Pluripotenz aufrechterhält. Eine Manifestation des ruhenden Zustandes verwurzelt in WSR genetische Information ist das so genannt Mindest Phänotyp - auf der Oberfläche des ESC von einer begrenzten Anzahl von Rezeptoren exprimieren und daher nur sehr wenige Programme eingesetzt transsignalizatsii Kernapparat der Zelle mit ihrer Mikroumgebung interagieren. Vor dem Hintergrund der Gene, die für den Ruhezustand die Beschränkung der spezialisierten Zelllinien und die Differenzierung von Zellen, nur etwa 30 der 500 Gene, deren Produkte bieten Zellen mit der umgebenden Mikroumgebung Kommunikation aktiviert. Mit der Methode der seriellen Analyse der Genexpression gezeigt, dass die Allgemeingültigkeit der Haupt funktionellen Genomkästen Energie und Metabolismus in somatischen Zellen und WSR in letzter bestimmt äußerst geringer Menge an mRNA der Rezeptoren regulieren, G-Proteine, sekundärer Botenstoffe, Transkriptasen, Cofaktoren Expression und Repression das heißt, das gesamte System der transmembranen Übertragung des Regulationssignals in die Zelle. Dies liegt an der fehlenden oder sehr geringen Expression von Transsanalisierungsgenen. Während der Differenzierung in dem Genom von 18 ESC Operation induziert wird synchron Gene für die Hintergrundaktivierung transsignalizatsii 61-Gen steuert die Synthese von Zelladhäsionsrezeptoren, extrazellulären Matrixkomponenten funktionieren gestoppt Transkriptasen Restriktions messendzhernyh Elemente und Signalübertragungssystem für eine Kerneinheit mit den Plasmazellmembranrezeptoren. Gleichzeitig blockiert die Expression von Genen, die für die Synthese von Proteinen Schalldämpfern sowie Genexpression koingibitorov Totipotenz Genom hESCs bereitstellt.

Genetische Marker wurden für die Zellen aller drei embryonalen Blättchen gefunden. Identification ektodermale Zellschicht auf der Expression von Genen durchKnoten, OCT3 und FGF-5, Mesodermzellen - Gene Brachyury, zeta-Globin, Endoderm - an GATA-4-Genexpression. Im normalen Embryonalentwicklung, während der Gastrulation beobachtet eine aktive Migration von unreifen Populationen von Stamm- und Vorläuferzellen, lokal Bereiche der Gesichtsknochen des Schädels Bezeichnen, einige Teile des Gehirns, des peripheren Nervensystems, Herzleitungssystems und Thymusgewebe, die aus Klonen verschoben Zellen gebildet werden. Zellmarkierung frühen Gene Keimschichten erleichtert topographischen Analyse der Migration von Vorläuferzellen im sich entwickelnden Embryo. Insbesondere ist es, dass die Zellen in Aggregaten embryocarcinoma P19 Expression des ersten Gens Mesoderm Brachyury beginnt während der Reduktion der Genexpression von Gewebe-Plasminogen-Aktivator, a-Fetoprotein, Keratin 8, und Keratin 19, das sind Marker der frühen Mesoderm wandernde Populationen gefunden. Folglich beginnt die Bildung von Geweben mesodermalen Ursprungs erst nach dem Prozess der Migration und das Absetzen Punkt mesodermalen Vorläuferzellen.

Mit extrem begrenzten phänotypischen Merkmalen und das Fehlen des meisten der Blöcke transsignalizatsii ESC dennoch einige Rezeptormoleküle exprimieren, die verwendet werden können, um sie zu identifizieren. Es ist bemerkenswert, dass Antigenmarker von ESCs in Menschen und Primaten sich als häufig erwiesen haben. Am häufigsten zum Etikettieren hESCs markierten Antikörper gegen Antigene verwendet membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (einzigartige Lipid-Komplex-Antigene repräsentieren Glykolipid GL7 mit Sialinsäure) sowie hochpolymere Glykoproteine TRA-1-81, TRA-1-60. Weiterhin exprimieren hESCs spezifische embryonale Antigen SSEA-1 und endogene alkalische Phosphatase, sowie einen spezifischen Transkriptionsfaktor Oct4. Letzteres ist erforderlich für hESCs Proliferationsmechanismen Aufrechterhaltung - spezifischen Transkriptionsfaktor Oct4-Gen aktiviert die Expression von Fibroblasten-Wachstumsfaktor-4-Genexpression und stabilisiert Boxen, die für nicht-beschränkenden DNA reduplication in unreifen Zellen. Die wichtigsten intrazellulären Markerproteine sind Oct3, Oct4, Tcf und Groucho, die mit Chromatin-Silencer-Proteinen verwandt sind.

Fast unmittelbar nach den langfristigen kultiviert WSR Versuchen erfolglos ist und der Organismus wurde zuerst von Kultur von Stammzellen isoliert von Mausblastozysten und primärer Keimzellkultur hergestellt, begannen Studien Stufe ESC Pluripotenz Kapazität, wenn in den frühen Stadien der Embryonalentwicklung verabreicht. Es wurde, dass an der Morula gezeigt und Blastozyste PGCs können chimäre Embryos bilden, in dem die Donor-PGCs Abkömmlinge in allen somatischen Geweben nachgewiesen und auch in Gameten. So wird in Developmental Biology mit ESC scripting „Brücke“ zwischen den experimentellen Studien in vivo und in vitro, was deutlich die Möglichkeit von Prozessen erhöhten Lesezeichen primäre Gewebe und Organe zu studieren, und deren Differenzierung embryonale Organogenese.

Es ist klar belegt, dass in vivo im Prozess der Embryogenese ESCs in die frühe Keimzellmasse integriert sind und ihre Derivate in allen Organen und Geweben vorkommen. ESCs besiedeln im chimären Embryo eine Linie von Geschlechtszellen, deren Nachkommen ausgewachsene Samenanlagen und Spermatozoen bilden. Embryonale Stammzellen sind klonogenen - single PGCs können schaffen genetisch identisch mit einer Kolonie von Zellen, die mit molekularen Markern, das Oct4-Genexpression und alkalische Phosphatase, hohe Telomerase-Aktivität enthalten sowie embryonale Expression spezifischer Antigene.

Um die Mechanismen der Embryonalentwicklung zu untersuchen die Technik der hESCs Chimärisierung Morula unter Verwendung von einer biologischen Struktur zu schaffen, die Außenschicht tetraploide Blastomeren Empfänger- und Spender-PGCs verabreicht werden, liegt in. So ist aus Nachkommen gebildet Trophoblasten tetraploide Blastomeren Empfänger, der Implantation und placentation und Donor-PGCs, die als die innere Zellmasse ermöglicht es, die von einer lebensfähigen Keimbahn des Grundkörpers und Vorläufer Gameten gebildet wird. Studie ESC Wert liegt nicht nur darin, dass, wenn die Manipulation in vitro mit ihrem Genom Pluripotenz beibehalten, sondern auch in der Tatsache, dass, während der Fähigkeit zur Bildung von hES Urkeimzellen des chimären Embryos teilnehmen zu bewahren. Es wird gezeigt, dass nur ein Nachkommen genetisch veränderten PGCs kolonisiert alle primären und Gewebe chimärer Embryo bilden Keime durch Aggregation oder Co-Kultur der Zellen mit 8-Zell-Embryonen erhalten. Wenn sie in die Maus von ESC-Mäusen transplantiert wurden, die mit dem grün fluoreszierenden Proteingen transfiziert waren, wurden die fluoreszierenden Nachkommen dieser Zelle in allen Testgeweben des sich entwickelnden Embryos gefunden (Shimada, 1999). Die Transplantation von ESC in die Morula ermöglicht die Schaffung von lebensfähigen Mäusen, deren Körper nur aus Nachkommen des Spenders ESC besteht, was Perspektiven für verschiedene Möglichkeiten des therapeutischen Klonens eröffnet. Dieser methodische Ansatz wird nun erfolgreich genutzt, um die Probleme der Entwicklungsbiologie zu untersuchen, insbesondere analysiert er die Mechanismen der genetischen Inaktivierung des X-Chromosoms oder der epigenetischen Instabilität von ESC. Die Transplantation von ESC in den frühen Embryo wird auch in der Biotechnologie in der Landwirtschaft sowie in Gentherapie-Experimenten eingesetzt.

Transplantate von genetisch modifizierten ESCs werden verwendet, um die Zielzellen mutierter Gene zu testen. In-vitro-kultivierte ESCs werden in der Biotechnologie verwendet, um Knockout-Mäuse zu erzeugen. Dazu wird das zu untersuchende Gen durch homologe Rekombination aus dem ESC entfernt und die Zellen, denen dieses Gen fehlt, auf selektiven Medien isoliert. Dann werden Knockout-ESCs in die Blastozyste injiziert oder mit Blastomeren von Morula aggregiert. Die so erhaltenen chimären frühen Embryonen werden in einen weiblichen Empfänger transplantiert und neugeborenen Mäusen bei Personen mit Gameten nullizigotnymi dieses Gens ausgewählt. Mit dieser Technologie wurden viele Linien von Knockout-Mäusen geschaffen, die in der experimentellen Biologie und experimentellen Medizin weit verbreitet sind. Auf solchen biologischen Modellen wird die Bedeutung bestimmter Gene in der Embryonalentwicklung untersucht, ebenso wie ihre Rolle in den Mechanismen von Krankheiten und pathologischen Zuständen des Menschen. Darüber hinaus werden die Linien der Knockout-Tiere in der präklinischen Testphase neuer Gentherapiemethoden eingesetzt. Zum Beispiel, zu verwalten unter Verwendung der Gentransfektion in ESK normalen Allel des mutierten Gens effektiv Mutation korrigiert, trifft auf das blutbildenden System. Die Einführung von Alien-Genen in das ESC erlaubt die Erzeugung von Linien homozygoter transgener Labortiere mit einer beschleunigten Rate. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die Technik der gerichteten Rekombinations-Deletion von Genen vorläufig nur in Bezug auf das ESC von Mäusen zuverlässig ausgearbeitet wurde. Verwendung von murinen WSR installierte Doppel-Knockout-funktionellen Rolle Bereich Cluster von Genen auf Chromosom 7 (copy genomischen Region 19 Minuten menschliche Chromosoms) und den proximalen Abschnitt des Chromosoms 11 (kopiert menschliche Chromosoms 5d) - Deletion dieser Gene in ESK-Mäuse dürfen die Funktion ihrer Analoga beim Menschen beurteilen.

Die Kapazitätsfunktionsstudien von menschlichen embryonalen Genen, Transfektion in Gen, die Labortiere hESCs insbesondere Krypto erlaubt, die Rolle des Gens im Register zu klären und die kardiogenen Mesoderm, Pax-6-Gene bilden, - in der Embryonalentwicklung Auge. Stellt die erste Expression von Genen in unreifer wuchernden Karte ESC Teratocarcinoma und Blastozyste Mäuse überwältigende Repression in ESK transsignalizatsii Genen bestätigt. Die Kombination von mutierten WSR 60-80 und 20-30 Zellen von normaler Pre-Implantation Mausembryonen führt zur Entwicklung von chimären Embryonen, bei denen den Favoriten Körper bestehen aus Spender- und Empfängerzellen gefertigt, die uns die Rolle von unbekannten Genen in Gastrulation und Organogenese bestimmen können. Funktionskarte von Gen-Mausembryonen vergrößerte Details der Rolle des Gen SF-1 Registers in der Nebenniere und genitalen primordia, WT-1-Gen zu entwickeln - in der Nieren Register myoD Familie Gene - in der Lasche des Skelettmuskel-Genfamilie GATA-1-4 - in der Restriktions Reifung Rudimente der Erythro- und Lymphopoese.

Regie aus den mütterlichen und väterlichen Allele von Genen in hESCs Vektor-Rekombinase unter Verwendung diente dazu, die Funktionen verschiedenen Gene während der frühe Embryonalentwicklung und Technologie-Targeting der menschlichen unbekannten Gene in der Maus WSR auf die Entdeckung neuer mutierten Gene verantwortlich für die Entwicklung von schweren Erbkrankheiten beitragen zu klären. Verwendung von Knockout-Verfahren zum Verlegen embryonale Gewebe obligate Bedeutung einiger Gene definiert ist: GATA-4 - für Infarkt, GATA-1 - bis erythroiden hämopoetische Gewebe, myoD - Skelettmuskel, Brachyury - für Mesoderm Restriktions Transkriptasen HNF3 und HNF-4 - für Leberstammzellen, rag-2 - Lesezeichen für Klone von T und B-Lymphozyten (Repin, 2001). Doppel Deletion von Genen in hESCs hat Zugriff auf die Untersuchung der funktionellen Rolle der Gene der Keimblätter, Segmentierung und Homöosis und ESC Transplantation angesichts der Möglichkeit des Erhalts tragfähige interHybridEmbryos geöffnet. Mit verbesserten Verfahren zur Transplantation von Donor-PGCs in einem einzigen 8-Zellen-Embryos gezeigt, dass die Chimärisierung auf zellulärer Ebene vieler Organe des Empfängerembryos. Beachten Sie, dass Zellsprossen im menschlichen Gewebe Empfängermaus Organen nach der Verabreichung von humanen hämatopoetischen Stammzellen in eine Blastozyste zu finden sind. Es wurde festgestellt, dass pluripotente ESCs in murinen Embryonen während der Organbildung im Blut zirkulieren. Es ist möglich, dass ihre biologische Funktion in der embryonalen Organisation des zukünftigen Immunsystems liegt. Mit ESC in vitro reproduziert geeignete Modelle der menschlichen genetischen Krankheit: double knockout-Modelle Dystrophin-Gen in Mäusen von Duchenne-Muskeldystrophie, shutdown atm Gen (Steuersignalsynthese kinase Chromatin) - Ataxia teleangektaziyu. In diesem Fall entwickelt sich eine tödliche Erbkrankheit bei Kindern aufgrund von Defekten in der DNA-Reparatur Degeneration der Purkinje-Zellen im Kleinhirn, die durch eine Rückbildung des Thymus durch den Tod der wuchernden Zellen einhergeht. Clinic, Pathophysiologie und patomorfologija Ataxie-teleangek- tazii über die Einführung in die ESC abnorme genetische Information von Mäusen Chimären reproduziert entspricht die beim Menschen. Weiterhin Ataxie-teleangektazii PGCs und Knockout-Mäuse entwickelten experimentellen Modell, einige erbliche homozygote menschliche Krankheiten, die mit Störungen des Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsels, Katabolismus von Aminosäuren, die Entfernung von Kupfer und Bilirubin verwendet wird, die erheblich die Möglichkeit der experimentellen Medizin für die präklinische Erprobung neuer Verfahren zur Behandlung von relevanten Krankheiten erhöht Rechte.

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Die Verwendung von Stammzellen Zytohybrid

Die Hybridzellen durch Fusionieren somatischer Zellen aus hESCs erhalten, sind ausreichend und vielversprechendes Modell Pluripotenz und Reprogrammierung der Stammzellen differenzierten Zellchromosomen für die Untersuchung. Tsitogibridy durch die Fusion von ESC erhalten mit differenzierten Zellen des erwachsenen Tieres, eine Gelegenheit, die Beziehung zwischen den Genomen verschiedenen „Alters“ zu studieren: entwickelt eine einzigartige Situation, in der die homologen Chromosomen von Zellen verschiedenen Differenzierungsstadien abgeleitet und Reifegrade, sind in dem gleichen Kern variiert, wo sie leicht transdeystvuyuschimi teilen Regulationssignale. Es ist schwierig, vorhersehen, wie wird tsisregulyatornye epigenetischen System der homologen Chromosomen reagieren während yn bestehenden Dividuum Entwicklung erfolgt in Reaktion auf die Auswirkungen transdeystvuyuschih Signale von embryonalen verwandten Genomen. Darüber hinaus wird in den Hybridzellen Segregation elterlichen Chromosoms, das die Interaktion der Genome auf getrennten Chromosomen Ebene zu untersuchen erlaubt, das heißt, identifizieren möglicherweise den Teil der spezifischen Chromosom bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz, oder im Gegenteil, eine Ausgabe in Differenzierung.

Als erstes experimentelles Modell zur Untersuchung der Interaktion von Genomen mit unterschiedlicher "Entwicklungsgeschichte" wurden Zytohybride verwendet, die durch Fusion von pluripotenten Teratokarzinomen und differenzierten somatischen Zellen gewonnen wurden. In einigen Fällen behielten solche Hybridzellen pluripotente Eigenschaften auf einem ausreichend hohen Niveau. Insbesondere induzierten in vivo Teratokarzinom-somatische Hybridzellen die Entwicklung von echten Teratomen, die die Derivate aller drei Keimblätter enthielten, und in vitro wurden Embryoidkörper in Suspensionskulturen gebildet. Auch bei interspezifischen Cytohybriden dieses Typs wurden embryonale Antigene in Fällen beobachtet, in denen somatische Partner bei der Fusion mit Teratocarcinomzellen Lymphozyten oder Thymozyten aufwiesen. Es ist bemerkenswert, dass die Zyto-Hybride, die durch die Fusion von Teratokarzinomzellen mit Fibroblasten erzeugt wurden, Fibroblasten entsprechend dem Phänotyp entsprachen.

Die wichtigste festgestellte Tatsache ist, dass in teratokarzinom-somatischen Hybridzellen Anzeichen für eine Reprogrammierung des Genoms differenzierter Zellen auftraten, die durch die Reaktivierung einzelner Gene oder eines inaktiven X-Chromosoms des somatischen Partners gekennzeichnet war. So zeigen die Ergebnisse von Untersuchungen an Cytohybrididen wie Teratocarcinoma-somatischen Zellen, dass Hybridzellen oft Pluripotenz beibehalten und es Anzeichen für eine Reprogrammierung des Genoms des somatischen Partners gibt.

In den Experimenten embryonale intraspezifische Hybridzellen zu erhalten, indem Splenozyten mit der Maus WSR erwachsenen Tiere studierten Eigenschaften wie tsitogibridov, Segregationsanalyse der elterlichen Chromosom und bewerten Pluripotenz Hybridgenom zu verschmelzen. Für die interspezifische Hybridzellen durch Fusion Teratokarzinom-Zellen mit somatischen Zellen, gekennzeichnet durch im Allgemeinen geringe Segregation von Chromosomen mit tetraploiden oder fast tetraploiden Karyotyp. Eine ähnliche chromosomale Zusammensetzung wurde im Zytohybrid durch Fusion von primären Geschlechtszellen mit Lymphozyten beobachtet. Zur gleichen Zeit markierten interspezifische Hybridzellen, die als Ergebnis der Fusion von Maus-Teratokarzinomzellen mit Nerzlymphozyten erhalten wurden, eine intensive Chromosomensegregation des somatischen Partners.

Eine qualitativ neue Stufe in der Studie der Segregation von elterlichen Chromosomen in Arthybriden kam nach der Entwicklung von Verfahren, Mikrosatelliten-Analyse der Polymerasekettenreaktion verwendet wird, wobei jeder Mauschromosom einige hundert Markern gefunden, so dass zuverlässig zwischen jedem Paar homologer Chromosom in den Hybridzellen unterscheiden.

Durch die Zusammenführung ESK (unter Verwendung von HM-1-Zellen eines Mangel an gipoksantinfosforiboziltransferazy Aktivität, 2n = 40, XY, isoliert aus Blastozysten Mausstamm 129 / 01A) mit Splenozyten von Mäusen, kongene Linie DD / c den Satz von Hybrid-Klone erhalten versagt hatte morphologisch Ähnlichkeit zu hESCs. Alle Klone wurden auf einem selektiven Medium isoliert, in dem nur Zellen mit aktiver Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase wachsen können. Die elektrophoretische Analyse zeigte die Anwesenheit aller Klone Allelvariante gipoksantinfosforiboziltransferazy charakteristischen Mäuse DD / c. Mit zytogenetische Analyse wurde festgestellt, dass vier hatten drei Hybrid-Klone okolodiploidny der Chromosomen festgelegt. Ein nahezu tetraploid Klon enthielt zwei Populationen von Hybridzellen, von denen einer tetraploiden war und der zweite, kleinere - diploid.

Analyse von Mikrosatelliten jedes Paar von homologen Chromosomen 129 / 01A und DD / c-Maus, mit okolodiploidnym Satz in den Hybridklonen zu unterscheiden erlaubt zeigte, dass Klone, die in zwei unterschiedlichen Vorzugseliminationsautosomen somatischen Partner auftrat. Die meisten autosomal-Klone HESS2 und HESS3 hatte Marker 129 / 01a Linie, dh pluripotente Partner. Die Ausnahme war das Chromosom 1 und I: Klone HESS2 und HESS3, zusammen mit Markern der HM-1-Zellen, eine kleine Anzahl von Markierungen vorhanden somatischen Partner. Diese Ergebnisse spiegeln möglicherweise unvollständige Trennung der Chromosomen 1 und und somatische Partner und stehen im Einklang mit zytogenetischen Daten, dass Trisomie der Chromosomen, die in 30-40% HESS2 und HESS3 Zellklone auftritt. HESS4 Klon unterschied sich signifikant in der chromosomalen Zusammensetzung: viele Autosomen Dieser Klon von dem Genom ESK entstand (Chromosomen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 und 17), aber Chromosomen 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 und 19 wurden durch Homologe beider Eltern repräsentiert. Das quantitative Verhältnis von Mikrosatelliten, die diese homologen Chromosomen markierten, entsprach ungefähr 1: 1. So konnte die Autoren darauf hin, dass ein Homolog aus dem Genom des ESC und die anderen abgeleitet ist - aus differenzierten Zellen. In einigen Subklone von Klon HESS4 beobachtet nur Token Vorhandensein von Chromosomen 18 und 19 somatischer Partnern. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zellen HESS4 klonen, zusätzlich zur Trennung der Chromosomen somatischer Partner, da die Beseitigung eines oder beider Homologe des obigen Chromosom pluripotenten Genoms war, das heißt, es gab eine zweiseitige Trennung der Chromosomen beider Elternteile - das Phänomen recht ungewöhnlich ist, weil tsitogibridov charakteristische Verteilung der Chromosomen nur einer der Eltern.

Außerdem enthielten nach der 20. Passage alle Klone von Hybridzellen ausschließlich X-Chromosom-Marker des somatischen Partners, dh in den Klonen wurde das X-Chromosom von ESC durch das X-Chromosom des somatischen Partners ersetzt. Dies wird durch in situ-Hybridisierungsdaten unter Verwendung einer FITC-markierten Sonde, die für das Maus-X-Chromosom spezifisch ist, bestätigt: Ein positives Signal wurde nur auf einem Chromosom nachgewiesen. Es ist anzumerken, dass in früheren Kultivierungsstadien (bis zur 15. Passage) laut zytogenetischen Daten in vielen Zellen zwei X-Chromosomen vorhanden waren. Folglich ermöglicht die Verwendung von selektiven Medien, die chromosomale Zusammensetzung von Hybridzellen zu manipulieren und selektiv Klone, die einzelne Chromosomen des somatischen Partners tragen, gegen den Hintergrund des ESC-Genoms zu richten.

Als einzigartiges Merkmal des Genoms tsitogibridov die Lokalisierung der elterlichen Genome in einem einzigen Kern ist natürlich, wirft die Frage auf die Eigenschaften von pluripotenten embryonalen Genoms ESC-somatischen Zellhybriden unter den Bedingungen der engen Kontakt mit dem Genom von differenzierten Zellen beibehalten wird. Morphologisch ähnelte das Zytohybrid von ESC und somatischen Zellen der elterlichen Linie des ESC. Die Auswertung der Pluripotenz zeigte, dass alle Klone mit einem nahezu diploiden Chromosomensatz Embryoidkörper in Suspensionskulturen bilden konnten, in denen Derivate von drei Keimblättern vorhanden waren.

Die meisten Hybridzellen enthielten das ECMA-7-Antigen, einen Marker, der für frühe Mausembryonen charakteristisch ist, und wiesen auch eine hohe Aktivität von alkalischer Phosphatase auf. Die überzeugendsten Daten über die hohen pluripotenten Eigenschaften von Hybridzellen wurden in Experimenten erhalten, um eine Reihe von Injektions-Chimären unter Beteiligung von Hybridzellen des Klons HESS2 zu erhalten. Eine Analyse von biochemischen Markern zeigte, dass Nachkommen von Spenderhybridzellen in den meisten Chimärgeweben gefunden wurden. Daher behalten Hybridzellen, die durch Fusion von ESC und somatisch differenzierten Zellen erhalten werden, die Pluripotenz auf einem hohen Niveau, einschließlich der Fähigkeit, Chimären zu bilden, wenn sie in die Blastozystenhöhle eingeführt werden.

Die Klone HESS2 und HESS4 unterschieden sich signifikant in der Zusammensetzung der Elternchromosomen, aber sie hatten ähnliche pluripotente Eigenschaften. Man könnte glauben, dass Pluripotenz im Hybridgenom sich als dominantes Merkmal manifestiert, aber es ist möglich, dass nicht alle Chromosomen des embryonalen Genoms in den Prozess der Aufrechterhaltung der Pluripotenz involviert sind. Wenn diese Annahme zutrifft, kann man erwarten, dass die Elimination einiger Chromosomen des pluripotenten Partners aus dem Hybridoma-Genom nicht mit einer Änderung ihres pluripotenten Status einhergeht. In diesem Fall würde eine Analyse der Segregation von elterlichen Chromosomen in embryonalen Hybridzellen einen nahen Zugang zur Identifizierung von Chromosomen ermöglichen, die für die Kontrolle der Pluripotenz von embryonalen Zellen verantwortlich sind.

O. Serov und Co-Autoren (2001) fanden unter 50 Nachkommen, die durch Kreuzung von Chimären mit normalen Mäusen erhalten wurden, wie sie den Genotyp von Mäusen 129 / 01a und das X-Chromosom von DD-Mäusen tragen würden, nicht. Die Autoren sehen den Grund dafür in der Reduktion der Pluripotenz in Hybridzellen unter dem Einfluss des somatischen Genoms. Eine alternative Erklärung könnte der negative Effekt der Trisomie auf einige Autosomen und Ungleichgewichte in Geschlechtschromosomen (XXY wurden in Zellen vor der 15. Passage beobachtet) in Hybridzellen sein, wenn sie die Meiose passierten. Es ist bekannt, dass Zellen von XXY Meiose nicht passieren und Gameten bilden können. Die Trisomie kann auch eine Abnahme der proliferativen Aktivität von Hybridzellen bewirken, wodurch der selektive Vorteil in der Entwicklung von Chimären zu den Zellen des Empfängerembryos gehören kann. Daraus folgt, dass es notwendig ist, hybride Klone mit einem normalen diploiden Chromosomensatz zu erhalten, um das pluripotente Potential von Hybridzellen angemessen zu bewerten.

In Experimenten Serova O. Et al (2001) zeigten zuerst die Möglichkeit der Umprogrammierung des X-Chromosoms in das Genom einer somatischen Zellhybridzelle. Diese Schlußfolgerung folgt aus den Autoren, die Expression von Chimären HPRT-Gen (X-Chromosom Marker) zu analysieren: die Anwesenheit von Allelvarianten HPRT DD / c-Mäuse in allen analysierten Geweben chimären nachgewiesen wurden. Es soll nach der Einführung von Hybridzellen in den Blastozystenhöhle tsitogibridy in nicht-selektiven Bedingungen fallen und die Erhaltung des X-Chromosoms in dem Genom der Hybridzellen betont wird, dass bedeutet, dass es ein obligater Bestandteil seines Genoms worden ist und nicht diskriminieren es aus dem Chromosom pluripotenten Partnern Y.

Die Autoren fassen die Ergebnisse der Analyse der Interaktion somatischer und pluripotenter Genome in hybriden embryonalen Zellen zusammen und kommen zu dem Schluss, dass sich Pluripotenz bei einigen Zytohybriden als dominantes Merkmal manifestiert. Ein Hybridgenom ist in der Lage, einzelne Chromosomen differenzierter Zellen umzuprogrammieren, was jedoch die Möglichkeit einer umgekehrten Wirkung des somatischen Genoms auf die Pluripotenz des embryonalen Genoms nicht ausschließt. Bei der Kultivierung von Hybridzellen tritt die Induktion der Differenzierung viel häufiger auf als in der ursprünglichen Elternlinie des ESC NM-1. Ein ähnlicher Effekt wird bei der Bildung von primären Kolonien beobachtet: viele primäre Kolonien von embryonalen Hybridzellen differenzieren in den frühen Stadien der Bildung mit großen Verlusten von Klonen während ihrer Selektion und Vermehrung.

Somit bewahren Cytohybride, die durch die Fusion von ESCs mit somatischen Zellen erzeugt werden, trotz des engen Kontakts mit dem Genom differenzierter Zellen die Pluripotenz als eine einzigartige Eigenschaft des embryonalen Genoms. Darüber hinaus ist es in solchen Hybridzellen möglich, die einzelnen Chromosomen, die aus den diffundierten Zellen stammen, umzuprogrammieren. Es bleibt unklar, wie vollständig die pluripotenten Eigenschaften des embryonalen Genoms in Hybridzellen bestehen, insbesondere ihre Fähigkeit, an der Bildung des embryonalen Weges in Chimären teilzunehmen. Dazu ist es notwendig, embryonale Hybridzellen mit einem normalen Karyotyp zu erhalten. In jedem Fall können die pluripotenten embryonalen Hybridzellen ein reales Modell zur genetischen Identifizierung von Chromosomen bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz oder ihrer Kontrolle als bilaterale Trennung der elterlichen Chromosomen potenziell bietet eine solche Gelegenheit beteiligt sein.

Nicht weniger attraktiv ist das Studium des Phänomens, das O. Serov und Koautoren (2001) als "chromosomales Gedächtnis" definieren. In einem Hybridgenom gibt es homologe Chromosomen in zwei alternativen Konfigurationen: Die Homologen des somatischen Partners sind einmal differenziert worden, während in den pluripotenten Partnerhomologen dieser Prozess gerade erst beginnt. Daher zeigt hohe pluripotenten Eigenschaften von Hybridzellen beibehalten wird, dass „pluripotent“ -Konfiguration Homologe ESC ziemlich stabil in Hybrid-Genome, trotz der Auswirkungen der transdeystvuyuschih Faktoren aus dem somatischen Partner ausgehen. Die oben beschriebenen Merkmale der Reprogrammierung differenzierter homologe Genoms Chromosomen während der Entwicklung von Chimären nicht ausschließen, die Möglichkeit, dass die ersten Stufen der Bildung in vitro und Kultivierung tsitogibridov sie ihren Status während der Differenzierung in vivo erworben behalten. Nach jüngsten Daten, wenn die embryonalen Hybridzellen in nicht-selektivem Medium zu übertragen, in dem es ein intensiven Ausscheidung Chromosomen nur somatischen Partner, d.h. Unterscheidet die Genom von Hybridzellen leicht Homologe nach in vitro-Kultur für 10-15 Passagen. Somit stellen embryonale Hybridzellen ein vielversprechendes experimentelles Modell dar, um nicht nur eine solche fundamentale Eigenschaft des embryonalen Genoms wie Pluripotenz zu untersuchen, sondern auch seine Alternativen - embryonale Differenzierung.

Therapeutische Wirksamkeit der embryonalen Stammzelltransplantation

Bevor wir die therapeutische Wirksamkeit der ESC-Transplantation und ihrer Derivate analysieren, fassen wir das obige Material zusammen. ESC Merkmale im Hinblick auf die vollständige Umsetzung der Embryonalentwicklung in vitro sind unzureichend, da der Fehler in diesem Fall aufgrund der Abwesenheit von mesenchymalen Stammzellen, die im Körper autonom und unabhängig von hESCs auftreten. Die genetische Potenz von ESC ist geringer als das genetische Potenzial der Zygote, daher wird es nicht direkt für das Klonen von Embryonen verwendet. Das einzigartige biologische Potenzial von ESC als einzige Zelle, in der Entwicklungsprogramme in voller Abfolge eingesetzt werden, findet sich in Studien zur Funktion von Genen. Mit Hilfe des ESC werden die ersten Kombinationen von Signalen, die die Expression von frühen und späten Genen, die für die Entwicklung von drei embryonalen Blättern kodieren, aktiviert, entschlüsselt. Die Erhaltung Genom Pluripotenz von WSR in vitro macht ihr einzigartiges Werkzeug zur Reparatur Regeneration, die für Zellverluste geschädigte Organe und Gewebe automatisch kompensieren kann. In einer idealen hypothetischen Ausführung kann davon ausgehen, dass „... Bei der Transplantation von Spender PGCs in dem Empfängerorganismus sind kompakt verpackt Programme übertragen, die unter günstigen Bedingungen in den Bau neuer tkani'7 fähig realisiert“ ... Effektiv integriert in den Körper des Empfängers als morphologische, funktional und funktional. "

Nach der Entwicklung von Methoden zur Monodifferenzierung von ESC begann natürlich die in vivo-Untersuchung der funktionellen Aktivität von Zellen, die in vitro aus einem einzelnen spezialisierten Klon erhalten wurden. Der proliferierende ESO-Klon erzeugt Populationen von wandernden Vorläuferzellen, die sich wirklich aktiv in die Gewebeschädigungszonen des Rezipienten integrieren können, der in der regenerativ-plastischen Medizin verwendet wird. Es wurde festgestellt, dass die Transplantation von Dopa-Neuronen in der Substantia nigra klinische Manifestationen im experimentellen Hemiparkinsonismus reduziert. Regionale Transplantationen von Spender-Nervenstammzellen reduzieren den Grad von motorischen Störungen, die durch Trauma oder Kontusion des Rückenmarks und des Gehirns verursacht werden. Erhalten und die ersten positiven Ergebnisse der Stammzelltransplantation bei demyelinisierenden Erkrankungen. Es scheint, dass die regenerativen plastischen Potenzen der ESCs unbegrenzte Möglichkeiten für die Verwendung der Zelltransplantation in der praktischen Medizin eröffnen. Bei der Transplantation in ektopische Zonen transformieren sich die ESCs jedoch unvermeidlich in Tumore. Bei subkutaner Injektion von ESC in immundefiziente Mäuse bilden sich Teratome. Wenn die ESK-Suspension unter die Kapsel des Hodens in syngenen Mäusen transplantiert wird, wird auch ein Teratom gebildet, das aus verschiedenen Geweben besteht, deren Zellen von allen drei embryonalen Blättchen stammen. In solchen Teratomen sind die Prozesse der reduzierten Organogenese äußerst selten.

Eine Reihe von Arbeiten liefert Informationen über die positiven Ergebnisse der Transplantation von frühen Derivaten von ESCOs bei Tieren mit einer experimentellen Pathologie. Zelle Neuro Derivate von PGCs verwendet, wird weiter in dem Experiment und die ersten klinischen Studien auf Beseitigung von Funktionsstörungen im Gehirn und Rückenmark-Trauma, Behandlung von syringomyelia und Multipler Sklerose (Repin, 2001) entwickelt. Mit dem Aufkommen der Technologie neyronogeneza WSR in vitro, anstelle der Verwendung von embryonalen Hirngewebe Transplantationstechnik Derivate von Neurosphären entwickelt, die aus Kulturen von embryonalen Nervengeweben erhalten. Solche Transplantationssuspensionen sind viel homogener und enthalten engagierte neuronale und neurogliatische Vorläufer.

Zusätzlich zu dem regulären Kulturmedium mit Retinsäure in einer Dosis von 10 ug / ml für 6 Wochen in embryonalen Linien (Teratome) NTera-2 Human -kartsinomy über 80% der postmitotischen Neuronen gebildet. Die vollständige Homogenität der neuronalen Population wird durch die Strömung erreicht Sortier markierten immunphänotypische Marker von reifen Neuronen, die von den Überresten loswerden können teratokartsinomnyh und unreifen Zellen. Nach Transplantation in verschiedene Regionen des Gehirns von Versuchstieren überleben solche Neuronen nicht nur, sondern sind auch in regionale neuronale Netzwerke eingebaut. Bei Tieren mit experimentellen Modellen von lokalen Defekten reduziert CNS Neuro klinische Manifestationen der menschlichen Pathologie wie die Auswirkungen von Schädel-Hirn-Trauma, Schlaganfall, demyelinisierende Erkrankungen, erblichen Kleinhirn Entwicklungsfehlern, Krankheiten Ablagerung von Lipiden und Polysacchariden.

Um die Prozesse der Regeneration bei degenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems zu optimieren Technologie von HSC mielinprodutsiruyuschih Oligodendrozyten entwickelt. Die erste Stufe beinhaltet traditionell die Vermehrung von ESCs mit der Vervielfachung der Anzahl von Zellen, die für die Transplantation notwendig sind. In der zweiten Stufe wird eine gerichtete Differenzierung von Zellen in eine Population von Myelin-produzierenden Oligodendrocytenvorläufern durchgeführt, die durch selektive Markerantigene kontrolliert wird.

Einige Aussichten sind für den Einsatz Derivate WSR geöffnet Verfahren zur Korrektur der Immunschwäche durch genetische Defekte bei der Reifung des Thymus verursacht zu entwickeln. In Studien, in Knockout (rag 1) Mäuse mit Gen-Defekt induzierte - Verletzung Rekombinationsmechanismus V (D) J-Genloci TCR, was zu einem Verlust der Funktion von T-Lymphozyten, Transplantation frühe Derivate von PGCs in Thymus Tiere gewinnt Reifung von normalen Populationen von Immun Klont verantwortlich für zelluläre Immunität. Klinische Versuche zur Transplantation von vorgeformten In-vitro-ESK zur Behandlung von tödlicher erblicher Anämie bei Kindern werden durchgeführt.

Einwände gegen die rasche Einführung der Stammzelltransplantation in die Klinik sind durch eine begrenzte Anzahl von stabilen Linien humaner embryonaler Stammzellen und die Notwendigkeit ihrer Standardisierung gerechtfertigt. Um die Reinheit von standardisierten ESC-Linien sowie von adulten Stammzellen zu erhöhen, wird eine Methode zur Linienselektion vorgeschlagen, die auf einer molekulargenetischen Analyse von kurzen Tandem-DNA-Wiederholungen basiert. Es ist auch notwendig, die ESC-Linien auf das Vorhandensein von kleinen chromosomalen Umlagerungen und genetischen Mutationen zu testen, die potentielle Möglichkeit ihres Auftretens unter Bedingungen der Zellkultivierung ist ausreichend hoch. Die Arbeit über die obligatorische Prüfung von Eigenschaften aller Arten von ESC und regionalen pluripotenten Stammzellen ist fortgeschritten, da ihre Reproduktion in vitro zum Auftreten neuer Eigenschaften führen kann, die Stammzellen des Embryos oder der definitiven Gewebe nicht innewohnen. Insbesondere wird angenommen, dass langfristige Kultivierung in Medien mit Zytokinen HESS näher an die Tumorzellen, da sie ähnliche Veränderung Wege Zellzyklus mit dem Erwerb der Fähigkeit, eine unbegrenzte Anzahl von Zellteilungen Regelung auftreten zu implementieren. Auf der Grundlage des Potentials für die Entwicklung von Tumoren betrachten einige Autoren die Transplantation von frühen Derivaten embryonaler Stammzellen als rücksichtslos. Ihrer Meinung nach ist es viel sicherer, die engagierten Nachkommen des ESC zu benutzen, dh die Linien der Vorfahren differenzierter Zellen. Eine zuverlässige Technik zum Erhalten stabiler humaner Zelllinien, die sich in der richtigen Richtung differenzieren, wurde jedoch noch nicht entwickelt.

So gibt es in der Literatur mehr und mehr Daten über den positiven therapeutischen Effekt der Transplantation von humanen embryonalen Stammzellderivaten. Viele dieser Werke unterliegen jedoch einer Revision und Kritik. Einige Forscher glauben, dass die Ergebnisse früher klinischer Studien vorläufiger Natur sind und nur darauf hindeuten, dass Stammzellen eine positive Wirkung auf den klinischen Verlauf einer Krankheit haben können. Daher ist es notwendig, Daten über die Langzeitergebnisse der Zelltransplantation zu erhalten. Als Argument werden die Stadien der Entwicklung der klinischen Neurotransplantologie angegeben. Tatsächlich in der Literatur, zunächst durch die Veröffentlichung der hohen Effizienz der Gehirntransplantationen Fragmente von Embryonen bei der Parkinson-Krankheit dominierte, aber dann begannen Berichte zu leugnen therapeutische Wirksamkeit von embryonalen oder fötalen Nervengeweben in das Gehirn von Patienten transplantierten zu erscheinen.

Durchgeführt, die ersten klinischen Versuche, die Sicherheit der Transplantation Neuroblasten Beurteilung - Derivate von PGCs NTera-2 Teratokarzinom, unreife Zellen, die in Kultur wuchern wurden Lager 100millionste Zellmasse unterworfen. Einige der so erhaltenen Zellen wurden verwendet, um den Phänotyp zu charakterisieren und Zellverunreinigungen zu bestimmen sowie um auf eine mögliche Kontamination durch Viren und Bakterien zu testen. Aus dem Kulturmedium wurde für die gerichtete Differenzierung von hES in Neuroblasten mit einer Kombination von Zytokinen und Wachstumsfaktoren LIF und Feeder-Schicht aus Stromazellen und fetalen erstellten Bedingungen entfernt. Dann wurden die Neuroblasten von unreifen Teratocarcinomzellen auf einem Fließkäfigsortierer gereinigt. Nach der zweiten Reinigung und Charakterisierung des Phänotyps von transplantierten Zellen Neuroblasten (10-12 Mio.) Suspension einer spezielle Spritze und Microcannulas Stereotaxievorrichtung und unter der Kontrolle von CT unter Verwendung injizierte in den Nucleus basalis des Gehirns des Patienten (der siebte Monat nach hämorrhagischem Schlaganfall). Ein einjähriges Screening der Folgen einer neuronalen Transplantation nach der Transplantation in der Schlaganfallzone zeigte keine Nebenwirkungen und Nebenwirkungen. Die Hälfte der Patienten erlebte eine Verbesserung der motorischen Funktion im Zeitraum von 6 bis 12 Monaten nach der Transplantation. Mittlerer Absorptions Erhöhung der fluoreszenzmarkierten 2-Desoxyglucose nach Positronemissionstomographie erreichte 18%, und bei einigen Patienten - 35%: Positive klinische Veränderungen wurden durch eine Erhöhung der Blutversorgung Hubzone nach der Transplantation der Zellen begleitet.

Das US-amerikanische National Institute of Health führte jedoch eine unabhängige Studie über die klinische Wirksamkeit der Neurotransplantation bei Parkinson-Patienten durch. Die Patienten der ersten Gruppe wurden mit embryonalem Nervengewebe transplantiert, das Dopamin produzierte, während die zweite Gruppe von Patienten sich einer falschen Operation unterzog. Die Ergebnisse zeigen eine klinische Null-Wirksamkeit einer solchen Neurotransplantation, trotz der Tatsache, dass Dopamin-produzierende embryonale Neuronen im Gehirn der Empfänger überlebten. Darüber hinaus wird nach 2 Jahren nach der Transplantation von fötalen Nervengeweben bei 15% der Patienten entwickelten persistent Dyskinesie, die bei Patienten in der Placebo-Gruppe fehlen (Stammzellen: wissenschaftliche Fortschritte und zukünftige Forschungsrichtungen Nat Inst, of Health USA ...). Beobachtungen der weiteren Entwicklung der Krankheit bei diesen Patienten gehen weiter.

Einige Autoren schreiben die widersprüchliche Literatur über die Bewertung der klinischen Wirksamkeit Neuro Daten mit einem anderen Ansatz für die Auswahl von Patientengruppen, unzureichender Auswahl an objektiven Methoden für ihren Zustand zu bewerten und, was am wichtigsten ist, verschiedene Bedingungen der Entwicklung des fetalen Nervengewebes und in verschiedenen Teilen des Gehirns, aus denen der Stoffe in verschiedenen Größen hergestellt Transplantation und methodische Merkmale der Chirurgie.

Es soll beachtet werden, dass die Transplantation von pluripotenten embryonalen Stammzellen in der striatale Region des Gehirns von Ratten mit experimentellen Körpern gemiparkinsonizmom begleitet ESC Proliferation und deren Differenzierung in dopaminergen Neuronen zu leiten versucht. Es muss davon ausgegangen werden, dass die neu gebildeten Neuronen wirksam in das neuronale Netzwerk aufgebaut als WSR nach der Transplantation Korrektur von Anomalien des Verhaltens und der Motor-Asymmetrie in Apomorphintest beobachtet wurde. Zur gleichen Zeit starben einige der Tiere aufgrund der Transformation von transplantierten ESK im Gehirntumor.

Experten des US-amerikanischen National und Medical Academy, Spezialist der National Institutes of Health glauben, dass das klinische Potenzial von hES ernsthafter Aufmerksamkeit verdient jedoch darauf bestehen, auf der Notwendigkeit eine detaillierte Untersuchung ihrer Eigenschaften, die Wahrscheinlichkeit von Komplikationen und Langzeitwirkungen in Experimenten mit ausreichenden biologischen Modellen menschlicher Erkrankungen (Stammzellen und der zukünftige regenerative Medizin National Academy Press, Stammzellen und die zukünftige Forschungsrichtungen., Nat. Inst, of Health USA).

Aus dieser Sicht ist es wichtig, dass die vergleichende histologische Analyse des experimentellen teratoma durch Transplantation in Hoden Slurry PGCs mit Teratomen erhalten, die durch Transplantation frühen Embryo entwickelt hat, die ebenfalls vorhanden ESC enthalten zeigte, dass ESK unabhängig von ihrer Herkunft oder Interaktion mit durch diese oder andere umgebende Zellen in gleicher Weise realisieren ihre tumorigenen Potenzen. Es erwies sich, dass eine solche Teratome einen klonalen Ursprung haben, wie von einem Tumor WSR auftreten können, bestehend aus den Derivate aller drei Keimschichten (.Rega, 2001). Es ist bemerkenswert, dass, wenn in immundefiziente Mäuse geklonten PGCs mit normalen Karyotyp transplantiert und Teratome gebildet, bestehend aus einer Vielzahl von Arten von differenzierten somatischen Zellen. Diese experimentellen Daten sind der perfekte Beweis für den klonalen Ursprung des Teratoms. Aus der Perspektive der Entwicklungsbiologie, sie deuten darauf hin, dass es nicht möglich, mehrere der festgelegten Vorläuferzellen und pluripotente Stammzellidentität ist die Quelle von differenzierten Derivate aller drei Keimschichten, teratoma Komponenten sind. Doch in den praktischen Zelltransplantation Ergebnisse dieser Studien sind, wenn nicht unerschwinglich, dann ein Warnsignal für mögliche Gefahr, da Impfung ESC oder Urkeimzellen in verschiedenen Geweben von erwachsenen immundefizienten Mäusen führt unweigerlich die Entwicklung von Tumoren aus den transplantierten Stammzellen. Neoplastischen Degeneration ektopisch ESC durch die Entstehung von Satelliten Populationen von differenzierten Zellen begleitet transplantiert - von teilweise unterscheidet sicherlich WSR und Vorläufer Klonen Standleitungen ist. Interessanterweise werden bei der Transplantation von ESC in Skelettmuskeln neben Teratokarzinomzellen am häufigsten Neuronen gebildet. Jedoch bei der Verabreichung von PGCs Mace Ei oder Blastozyste durch vollständige Integration in den Keimzellen, ohne die Bildung von neoplastischen Zellen begleitet. In diesem Fall sind ESCs in praktisch allen Organen und Geweben des Embryos einschließlich des sexuellen Rudiments eingebaut. Solche allophänischen Tiere wurden zuerst durch Einführung der Zellen des Teratokarzinoms 129 in frühe Embryonen in den Stadien von 8 bis 100 Zellen erhalten. In allofennyh Mäusen Populationen geterogenomnyh Zellen stamm Donor-PGCs in Knochenmark eingeführt, Darm, Haut, Leber und Genitalien, dass Sie in dem Experiment erstellen können auch Interspezies Zelle Chimären. Je kleiner die Zeit des frühen Embryos, desto höher ist der prozentuale Anteil der Zelle Chimerisierung, dem höchsten Grad Chimerisierung in das hämatopoetische System beobachtet, Haut, Nervensystem, Leber und Dünndarm allofennogo Embryo. Transplantat Urkeimzellen im Hoden Parenchym durch Insertion von Spenderstammzellen in die Empfängergewebe germenativny Schicht begleitet: im adulten Organismus aus der Exposition gegenüber dem Immunsystem der Empfänger gistogematicalkie Barrieren des Gewebes zugänglich Chimärisierung geschützt. Jedoch ESC Transplantation in eine Blastozyste Bildung chimärer primordia Genitalien mit Generation Donator Urkeimzellen nicht auftritt. ESC Pluripotenz, wenn spezielle Bedingungen geschaffen werden und kann für die Klonierung verwendet werden: ESC Transplantation Mäuse 8-16-Zell-Mausembryo, Zellmitose wobei tsitokalazinom blockiert ist, trägt zu der normalen Embryonalentwicklung mit der Entwicklung des Embryos Donor-PGCs.

Folglich ist eine alternative Transplantation von allogenen ESC therapeutischen Klonen, basierend auf somatische Zellkerntransplantation in eine entkernte Oozyte eine Blastozyste inneren Zellmasse zu erzeugen, aus dem dann die Linie von genetisch identischen Donor-PGCs somatischen Zellkern zugeordnet sind. Technisch ist diese Idee durchführbar, da die Möglichkeit der Schaffung von hESC Linien von Blastozysten nach der Transplantation von somatischen Zellkernen in entkernte Eizelle in Experimenten mit Versuchstieren wiederholt bewiesen erhalten (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Insbesondere bei Mäusen, die homozygot für die Mutation rag2 erhaltene Fibroblasten durch subepidermale Gewebszellen Züchten verwendet wurden als Donatorzellkernen in entkernte Oozyten transplantiert werden. Nach der Aktivierung Oozyten „Zygote“ kultiviert, bis Blastozystenbildung, aus der inneren Zellmasse isoliert PGCs ist und sie in eine Linie für die mutierte Gen nullizigotnyh Zellen (rag2 ~ / ~) verläuft. Durch homologe Rekombination in solchen ESCs wurde die Mutation eines allelischen Gens korrigiert. In der ersten Reihe von Experimenten aus hESCs rekombinantes Gen gewonnen Embryoidkörpern wurden hergestellt, transfizierte Zellen davon mit einem rekombinanten Retrovirus (HoxB4i / GFP), und nach der Ausbreitung in Mäuse injiziert Venen rag2 ~ / ~. In der zweiten Serie wurden tetraploide Blastomere mit genetisch modifizierten ESCs aggregiert und an ihre weiblichen Empfänger transplantiert. Die geborenen immunkompetenten Mäuse dienten als Knochenmarkspender zur Transplantation in mutierte Mäuse-Rag2 ~ / ~. In beiden Serien war das Ergebnis positiv: in 3-4 Wochen wiesen alle reifen Mäuse normale normale myeloide und lymphoide Zellen auf, die Immunoglobuline produzieren können. Somit kann die Transplantation in die Oozyte Kerne von somatischen Zellen nicht nur verwendet wird HES-Linien zu erzeugen, sondern auch für tsitogenoterapii - Korrektur der erblichen Abnormalitäten ESC als Vektor für den Transport von Korrektur genetische Information verwendet wird. Aber in dieser Richtung der Zelltransplantation gibt es neben bioethischen Problemen auch Grenzen. Es ist nicht klar, wie sicher wäre die Transplantation therapeutisch Zellen mit einem Genotyp identisch mit dem Genotyp eines bestimmten Patienten geklont werden, da solche Zellen Mutationen einführen können, die eine Prädisposition für bestimmte Krankheiten erstellen. Normale menschliche Eier bleiben unzugänglich Objekt, während auch bei somatischen Zellkerne in entkernte tierische Eizelle nur 15-25% engineered „Zygote“ entwickeln bis zum Blastozystenstadium Umpflanzen. Es ist nicht bestimmt, wieviel Blastozyste erforderlich ist, um eine einzelne Linie von pluripotenten klonierten ESCs zu erhalten. Es sollte angemerkt werden, dass die Komplexität der therapeutischen Klonierungsmethode mit hohen finanziellen Kosten verbunden ist.

Abschließend hypomethyliert im ESC Pluripotenz Genom-DNA mit hohen Telomerase-Aktivität vereinigt und kurzer C ^ Zellzyklus-Phase, die ein intensive und potentiell unendliche Multiplikation gewährleistet, während die die PGCs diploide Chromosomen und „juvenilen“ Satz von phänotypischen Eigenschaften beibehalten. Klonwachstum von PGCs in Kultur nicht ausschließen, dass sie in jede spezialisierte Zelle des Organismus an einer Stopplinie Proliferation und das Hinzufügen von geeigneten regulatorischen Signalen nicht unterscheiden. Restriction Differenzierung von hES in Linie in vitro somatischer Zelle ohne die Beteiligung von Mesenchym realisiert wird, unter Umgehung Nohteyaov ist Organogenese und ohne die Bildung des Embryos. Ektopische Verabreichung von ESC in vivo führt unweigerlich zur Bildung von Teratokarzinomen. ESC Transplantation in eine Blastozyste oder frühen Embryo in Begleitung ihrer Integration mit den Geweben des Embryos und seinem stabilen Chimerisierung Körper.

Regenerative und Kunststoff-Technologien auf Basis von Zelltransplantation ist der Schnittpunkt der Interessen der Mitglieder der Zellbiologie, Entwicklungsbiologie, experimentelle Genetik, Immunologie, Neurologie, Kardiologie, Hämatologie, und vielen anderen Bereichen der experimentellen und praktischen Medizin. Die wichtigsten Versuchsergebnisse belegen die Möglichkeit der Umprogrammierung die Stammzellen mit der Richtung der Veränderung ihrer Eigenschaften, die Perspektiven eröffnen sich für die Zelldifferenzierung Prozesse mit Wachstumsfaktoren zu steuern - für myokardiale Regeneration, die Wiederherstellung von ZNS-Läsionen und die Normalisierung der Funktion des Inselapparates des Pankreas. Für die breite Einführung der Transplantation von ESK-Derivaten in die praktische Medizin ist es jedoch notwendig, die Eigenschaften menschlicher Stammzellen genauer zu untersuchen und Experimente mit ESC in experimentellen Krankheitsmodellen fortzusetzen.

Bioethischen Fragen und das Problem der Abstoßung von allogenen Zelltransplantation könnten die beobachtete Plastizität des Genoms von regionalen adulten Stammzellen lösen. Allerdings ist die Erstinformation, dass, wenn die Leber isoliert und gründlich charakterisiert autologe hämatopoetische Zellen verpflanzen, von denen es neue Hepatozyten, in die Leberläppchen enthalten, werden nun geprüft und kritisiert. Allerdings veröffentlichten Daten, dass die Transplantation von neuralen Stammzellen im Thymus ist die Bildung von neuen Sprossen von Spender-T-und B-Lymphozyten und Zellen des Gehirns, des Knochenmarks neuralen Stamm Umpflanzen führt zur Bildung von hämatopoetischen germ anhalt Donator myeloiden und Erythropoese . Folglich kann in adulten Organen pluripotenten Stammzellen Umprogrammierung der ESC-Genoms fähig ist, um die Kapazität bewahrt werden.

Der menschliche Embryo bleibt die Quelle der Aufnahme des ESC für medizinische Zwecke, die die Unausweichlichkeit einer neuen Überschneidung moralischer, ethischer, moralischer, rechtlicher und religiöser Probleme zum Zeitpunkt der Geburt des menschlichen Lebens vorwegnimmt. Die Entdeckung der WSR gab der Wiederaufnahme harter Diskussionen darüber, wo die Grenze zwischen lebenden Zellen und Materie, Substanz und Persönlichkeit liegt, einen starken Impuls. Zur gleichen Zeit gibt es keine universellen Normen, Regeln und Gesetze in Bezug auf den Einsatz von ESC in der Medizin, trotz wiederholter Versuche, sie zu schaffen und zu akzeptieren. Jeder Staat innerhalb seiner Gesetzgebung löst dieses Problem von sich aus. Die Ärzte aus aller Welt versuchen weiterhin, über diese Diskussionen hinaus regenerative plastische Medizin zu entwickeln, vor allem durch den Einsatz nicht embryonaler Stammzellen und die Stammzellreserven eines erwachsenen Organismus.

Ein Teil der Geschichte der embryonalen Stammzellisolierung

Terato- (Embryo) Zellen wurden isoliert aus -kartsinomnye spontan testikulären Teratome Mausstamm 129 / Sv-ter, spontan ovarian Teratome Mauslinien Lt / Sv und von Teratome vorkommenden wurden ektopichno Quelle transplantierten Zellen oder embryonalem Gewebe. Unter den so erhaltenen terato- stabilen Mauslinien (Embryo) -kartsinomnyh einige Zellen sind pluripotent, andere wurden zu einer Differenzierung unterzieht nur in Zellen eines bestimmten Typs, und einige sind von Zelldifferenzierung im Allgemeinen nicht fähig gewesen.

Zu der Zeit lag der Schwerpunkt der Forschung, die eine mögliche Rückkehr terato- (Embryo) -kartsinomnyh Zellen zu normalen Phänotyp nach ihrer Einführung in den sich entwickelnden Embryo Gewebe zeigte, sowie die Arbeit in vitro genetisch veränderten terato- (Embryo) erstellen -kartsinomnyh Zellen, mit deren Hilfe mutierte Mäuse zur biologischen Modellierung der humanen erblichen Pathologie gewonnen wurden.

Zur Isolierung wird terato- Linien (Embryo) in einer Klimaanlage -kartsinomnyh Zellsuspensionskultur eingesetzt. In Kultur terato- (Embryo) -kartsinomnye Zellen, wie WSR, wachsen embryoid bodies zu bilden, und erfordern in eine Leitung übersetzt werden Bindung Dissoziation Pluripotenz auf einer Feeder-Schicht von embryonalen Fibroblasten oder Suspensionskultivierung in konditionierten Medien aufrechterhalten wird. Terato- pluripotenten Zellen (Embryo) - Karzinomlinien groß, kugelförmig, weisen eine hohe Aktivität der alkalischen Phosphatase, und bilden Aggregate sind von multidirektionalen Differenzierung fähig ist. Wenn in eine Blastozyste eingeführt werden, mit Morulae aggregiert, bei der Bildung von chimären Embryonen führt, die in den verschiedenen Organen und Geweben, die Derivate terato- (Embryo) -kartsinomnyh Zellen gefunden. Jedoch stirbt die überwiegende Mehrheit solcher chimären Embryonen in utero und in Organen Chimären Neugeborenen fremde Zellen überleben und selten mit einer geringen Dichte nachgewiesen. Zur gleichen Zeit die Häufigkeit von Tumoren (Fibrosarkom, Rhabdomyosarkom, und anderen Arten von bösartiger Geschwulst und Adenom Pancreas) stark erhöht, und neoplastischen Degeneration tritt häufig auch in utero chimären Embryonen.

Die meisten der Terato-Embryo-Karzinomzellen in der Mikroumgebung normaler embryonaler Zellen erwerben fast auf natürliche Weise maligne neoplastische Eigenschaften. Es wird angenommen, dass irreversible Malignität auf der Aktivierung von Proto-Onkogenen im Prozess der strukturellen Umlagerungen beruht. Eine Ausnahme ist die Zellinien embriokartsinomnoy SST3, Teratom abgeleitet von murinem testis (Linie 129 / Sv-ter), die eine hohe Fähigkeit aufweist, in das Gewebe und Organe des Fötus ohne die nachfolgende Bildung von Tumoren in chimären Mäusen zu integrieren. Derivate von Terato-Embryo-Karzinom-Zelllinien in Chimären-Mäusen sind praktisch nicht an der Bildung von primären Gonozyten beteiligt. Offensichtlich ist dies auf die hohe Häufigkeit von Chromosomenaberrationen zurückzuführen, die für die meisten terato- (Embryo-) Karzinomlinien charakteristisch sind, in Zellen, bei denen Aneuploidie und Chromosomenanomalien beobachtet werden.

Im Labor wurden mehrere stabile Linien von menschlichen Terato- Embryo-Karzinomen erhalten, die durch Pluripotenz, hohe proliferative Aktivität und die Fähigkeit, mit Wachstum in Kulturen zu differenzieren, charakterisiert wurden. Insbesondere wurde die Linie der menschlichen Terato- Embryo-Karzinomzellen NTERA-2 verwendet, um die Mechanismen der neuralen Zytodifferenzierung zu untersuchen. Nach Transplantation von Zellen dieser Linie in die subventrikuläre Region des Vorderhirns von neugeborenen Ratten wurden ihre Migration und Neuronogenese beobachtet. Es wurden sogar Versuche unternommen, die durch die Kultivierung der Zellen der Terato- Embryo-Karzinom-Linie NTERA-2 erhaltenen Patienten mit Schlaganfällen zu transplantieren, was nach Ansicht der Autoren zu einer Verbesserung des klinischen Krankheitsverlaufs führte. Zur gleichen Zeit wurden Fälle von malignen transplantierten Zellen der Terato-Embryo-Karzinom-Linie NTERA-2 bei Patienten mit Schlaganfall nicht beobachtet.

Die erste Zeile der undifferenzierten pluripotenten embryonalen Stammzellen von Mäusen in den frühen 80-er Jahren des letzten Jahrhunderts bekam Evans und Martin, indem sie aus der inneren Zellmasse der Blastozyste Auswahl - Embryo. Die isolierten ESC-Linien haben lange Zeit die Pluripotenz und die Fähigkeit zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen unter dem Einfluss von Faktoren eines speziellen Kulturmediums bewahrt.

Der Ausdruck „embryonale Stammzellen pluripotent“ gehört Leroy Stevens, dass die Untersuchung von Tabakteer Auswirkungen auf die Häufigkeit der Tumorentwicklung lenkte die Aufmerksamkeit auf das Auftreten von spontanen testikulären Teratokarzinom von linearen (129 / v) von Mäusen der Kontrollgruppe. Testikulären Teratokarzinom-Zellen wurden durch eine hohe Proliferationsrate charakterisiert, und in Gegenwart der Flüssigkeit in der Bauchhöhle nach links mit der Bildung von spontaner Differenzierung von Neuronen, Keratinozyten, Chondrozyten, Kardiomyozyten, sowie Haar- und Knochenfragmenten, aber ohne Hinweis auf eine geordnete Cytoarchitektonik entsprechende Gewebe. Wenn in Teratokarzinom Zellkultur Einpflanzen zu dem Substrat pluripotent Klont unattached gewachsen und gebildet embryoid bodies wurden dann in Neuronen differenzieren, um spontane Spaltung ungeordnete gequencht und zog, Gliazellen, Muskelzellen und Kardiomyozyten. Stevens gefunden, dass Teratokarzinom Maus 129 / v enthält weniger als 1% der Zellen, die in eine Vielzahl von spezialisierten somatischen Linie differenzierenden und sich Differenzierung hängt von Faktoren ab, die sie (Zusammensetzung Peritonealflüssigkeit, die Produkte zu der Kultur von reifen Zellen oder Geweben) beeinflussen. Leroy Stevenson Annahme über die Präsenz unter Teratokarzinomzellen embryonalen Vorläufer sexuellen Keimzellen bestätigt wurde: die Suspension Embryo Präimplantationsembryonen Zellen in adulten Mausgeweben gebildet Teratocarcinoma und getrennt von ihnen reinen Zelllinien nach intraperitoneale Verabreichung an Empfänger Tiere waren in Neuronen differenziert, Kardiomyozyten und andere somatische kletki Derivate aller drei Keimschichten. In Experimenten in vivo Transplantation ESK (von Embryo erhalten, aber nicht Trophoblasten) in Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien Linien 8-32 Blastomere beendet Geburt des chimären Tieres (keine Tumorbildung) in Organen, die Sprossen Spendergewebe erkennt. Chimärismus wurde sogar in der Linie der Geschlechtszellen beobachtet.

Primäre Vorläuferkeimzellen aus embryonalen Maus-Keim Geschlecht, Morphologie, immunologische Phänotyp und funktionellen Eigenschaften im Einklang mit hES abgeleitet von Teratocarcinoma Stevenson und Embryo isoliert. In Chimären, die nach der Verabreichung von ESC an die Blastozyste geboren wurden, war die allophrene Morphogenese der Organe durch einen Mosaikwechsel von Donor- und Empfängerstruktur- und Funktionseinheiten von Leber, Lunge und Niere gekennzeichnet. In einer Reihe von Fällen wurde die Bildung von Darmkrypten oder Läppchen der Leber beobachtet, die gleichzeitig aus den Empfänger- und Spenderzellen bestanden. Die Realisierung der Morphogenese erfolgte jedoch immer nach dem genetischen Programm der Spezies, zu der der Empfänger gehörte, und der Chimärismus beschränkte sich ausschließlich auf die zelluläre Ebene.

Dann wurde festgestellt, dass die Verbreitung von hES ohne Zelldifferenzierung auf einer Feeder-Schicht gewonnene mesenchymale Zellen (fötale Fibroblasten) erfolgt in Gegenwart von LIF in selektiven Nährmedien Bindung, die selektiv nur das Überleben von Stammzellen und Vorläuferzellen bereitstellen, während die überwiegende Mehrheit der spezialisierten Zellelemente stirbt. Mit Hilfe dieser Techniken im Jahr 1998 von James Thomson wurde fünf verewigt Linien von embryonalen Stammzellen aus der inneren Zellmasse der Blastozyste Person zugeordnet. Im selben Jahr hat John Gerhart ein Verfahren zum Isolieren der unsterblichen ESC Linien von sexuellen puff von vier bis fünf Wochen menschlichen Embryonen entwickelt. Aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften, nur zwei Jahre später embryonaler Stammzellen und endgültige Gewebe werden in der Praxis der regenerativen Medizin und Gentherapie verwendet werden Stammzellen begonnen.