Hämatopoetische Stammzellen aus dem Dottersack

Offensichtlich werden verschiedene proliferative und differenzierende Potenziale hämatopoetischer Stammzellen durch die Besonderheiten ihrer ontogenetischen Entwicklung bestimmt, da sich sogar die Lokalisierung der Hauptbereiche der Hämatopoese beim Menschen während der Ontogenese ändert. Hämatopoetische Vorläuferzellen des fetalen Dottersacks sind auf die Bildung einer ausschließlich erythropoetischen Zelllinie festgelegt. Nach der Migration primärer HSCs in Leber und Milz erweitert sich das Spektrum der Festlegungslinien in der Mikroumgebung dieser Organe. Insbesondere erwerben hämatopoetische Stammzellen die Fähigkeit, Zellen lymphatischer Linie zu erzeugen. In der pränatalen Phase erreichen hämatopoetische Vorläuferzellen die Zone der endgültigen Lokalisierung und besiedeln das Knochenmark. Während der intrauterinen Entwicklung enthält das fetale Blut eine signifikante Anzahl hämatopoetischer Stammzellen. Beispielsweise erreicht der HSC-Spiegel in der 13. Schwangerschaftswoche 18 % der Gesamtzahl der mononukleären Blutzellen. Anschließend ist eine fortschreitende Abnahme ihres Gehalts zu beobachten, doch schon vor der Geburt unterscheidet sich die Menge der HSZ im Nabelschnurblut kaum von der Menge im Knochenmark.

Nach klassischen Konzepten erfolgt die natürliche Veränderung der Lokalisation der Hämatopoese während der Embryonalentwicklung von Säugetieren durch Migration und Einführung pluripotenter hämatopoetischer Stammzellen in eine neue Mikroumgebung – vom Dottersack in Leber, Milz und Knochenmark. Da das hämatopoetische Gewebe in den frühen Stadien der Embryonalentwicklung eine große Anzahl von Stammzellen enthält, die mit zunehmender Reifung des Fötus abnimmt, gilt das hämatopoetische Gewebe der embryonalen Leber, das in der 5.-8. Schwangerschaftswoche aus abgetriebenem Material isoliert wurde, als vielversprechendste Methode zur Gewinnung hämatopoetischer Stammzellen.

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Fragen zur Herkunft hämatopoetischer Stammzellen

Es besteht kein Zweifel, dass die embryonale Bildung von Erythrozyten in den Blutinseln des Dottersacks beginnt. Allerdings ist das Differenzierungspotenzial hämatopoetischer Zellen des Dottersacks in vitro sehr begrenzt (sie differenzieren hauptsächlich in Erythrozyten). Es ist zu beachten, dass die Transplantation hämatopoetischer Stammzellen aus dem Dottersack die Hämatopoese nicht langfristig wiederherstellen kann. Es stellte sich heraus, dass diese Zellen keine Vorläufer adulter HSCs sind. Echte HSCs erscheinen früher, in der 3.-5. Woche der intrauterinen Entwicklung, in der Zone der Bildung von Magengewebe und Endothel der Blutgefäße (paraaortische Splanchnopleura, P-SP), sowie anstelle der Aorta, der Gonaden und der primären Nieren - im Mesonephros oder der sogenannten AGM-Region. Es wurde gezeigt, dass Zellen der AGM-Region nicht nur eine Quelle für HSCs, sondern auch für Endothelzellen von Blutgefäßen sowie für Osteoklasten sind, die an der Knochenbildung beteiligt sind. In der 6. Schwangerschaftswoche wandern frühe hämatopoetische Vorläuferzellen aus der AGM-Region in die Leber, die bis zur Geburt das wichtigste hämatopoetische Organ des Fötus bleibt.

Da dieser Punkt aus Sicht der Zelltransplantation äußerst wichtig ist, verdient das Problem des Ursprungs von HSCs im Prozess der menschlichen Embryogenese eine detailliertere Darstellung. Die klassischen Vorstellungen, dass die hämatopoetischen Stammzellen von Säugetieren und Vögeln aus einer extraembryonalen Quelle stammen, basieren auf den Studien von Metcalf und Moore, die als erste Methoden zum Klonen von HSCs und ihrer aus dem Dottersack isolierten Nachkommen anwandten. Die Ergebnisse ihrer Arbeit dienten als Grundlage für die Migrationstheorie, wonach HSCs, nachdem sie zuerst im Dottersack erschienen sind, nacheinander die vorübergehenden und endgültigen hämatopoetischen Organe besiedeln, während in ihnen das entsprechende Mikroumfeld gebildet wird. So wurde der Standpunkt etabliert, dass die Entstehung von HSCs, die zunächst im Dottersack lokalisiert sind, als zelluläre Grundlage für die definitive Hämatopoese dient.

Hämatopoietische Vorläuferzellen des Dottersacks gehören zu den frühesten hämatopoetischen Vorläuferzellen. Ihr Phänotyp wird durch die Formel AA4.1+CD34+c-kit+ beschrieben. Im Gegensatz zu reifen Knochenmarks-HSCs exprimieren sie keine Sca-1-Antigene und MHC-Moleküle. Das Auftreten von Markerantigenen auf den Oberflächenmembranen von Dottersack-HSCs während der Kultivierung scheint mit ihrer Differenzierung während der Embryonalentwicklung mit der Bildung dedizierter hämatopoetischer Linien zu korrespondieren: Die Expression der Antigene CD34 und Thy-1 nimmt ab, die Expression von CD38 und CD45RA nimmt zu und HLA-DR-Moleküle erscheinen. Mit der anschließenden, durch Zytokine und Wachstumsfaktoren induzierten Spezialisierung in vitro beginnt die Expression von Antigenen, die spezifisch für hämatopoetische Vorläuferzellen einer bestimmten Zelllinie sind. Die Ergebnisse der Untersuchung der embryonalen Hämatopoese bei Vertretern dreier Wirbeltierklassen (Amphibien, Vögel und Säugetiere) und insbesondere die Analyse des Ursprungs der HSCs, die für die definitive Hämatopoese in der postnatalen Ontogenese verantwortlich sind, widersprechen jedoch den klassischen Konzepten. Es wurde festgestellt, dass bei Vertretern aller betrachteten Klassen während der Embryogenese zwei unabhängige Regionen gebildet werden, in denen HSCs entstehen. Die extraembryonale „klassische“ Region wird durch den Dottersack oder dessen Analoga repräsentiert, während die vor kurzem identifizierte intraembryonale Zone der HSC-Lokalisierung das paraaortische Mesenchym und die AGM-Region umfasst. Heute kann argumentiert werden, dass bei Amphibien und Vögeln definitive HSCs aus intraembryonalen Quellen stammen, während bei Säugetieren und Menschen die Beteiligung von Dottersack-HSCs an der definitiven Hämatopoese noch nicht völlig ausgeschlossen werden kann.

Die embryonale Hämatopoese im Dottersack ist in der Tat eine primäre Erythropoese, die durch die Erhaltung des Zellkerns in allen Stadien der Erythrozytenreifung und die Synthese von Hämoglobin vom fetalen Typ gekennzeichnet ist. Nach neuesten Daten endet die Welle der primären Erythropoese am 8. Tag der Embryonalentwicklung im Dottersack. Es folgt eine Phase der Ansammlung definitiver erythroider Vorläuferzellen – BFU-E, die ausschließlich im Dottersack gebildet werden und erstmals am 9. Tag der Schwangerschaft auftreten. Im nächsten Stadium der Embryogenese werden bereits definitive erythroide Vorläuferzellen – CFU-E, sowie (!) Mastzellen und CFU-GM gebildet. Dies ist die Grundlage für die Annahme, dass definitive Progenitorzellen im Dottersack entstehen, mit dem Blutstrom wandern, sich in der Leber ansiedeln und dort rasch die erste Phase der intraembryonalen Hämatopoese einleiten. Demnach kann der Dottersack einerseits als Ort der primären Erythropoese und andererseits als erste Quelle definitiver hämatopoetischer Progenitorzellen in der Embryonalentwicklung betrachtet werden.

Es wurde gezeigt, dass koloniebildende Zellen mit hohem proliferativen Potenzial bereits am 8. Tag der Schwangerschaft, d. h. lange vor dem Verschluss des Gefäßsystems des Embryos und des Dottersacks, aus dem Dottersack isoliert werden können. Darüber hinaus bilden die aus dem Dottersack in vitro gewonnenen Zellen mit hohem proliferativen Potenzial Kolonien, deren Größe und zelluläre Zusammensetzung sich nicht von den entsprechenden Parametern des kulturellen Wachstums von Knochenmarkstammzellen unterscheiden. Gleichzeitig werden bei der Retransplantation koloniebildender Zellen des Dottersacks mit hohem proliferativen Potenzial deutlich mehr koloniebildende Tochterzellen und multipotente Vorläuferzellen gebildet als bei Verwendung von Knochenmarkvorläuferzellen der Hämatopoese.

Eine abschließende Schlussfolgerung zur Rolle hämatopoetischer Stammzellen des Dottersacks bei der definitiven Hämatopoese können die Ergebnisse der Arbeit liefern, in deren Rahmen die Autoren eine Linie von Dottersack-Endothelzellen (G166) gewannen, die die Proliferation ihrer Zellen mit den phänotypischen und funktionellen Eigenschaften von HSCs (AA4.1+WGA+, geringe Dichte und schwache Adhäsionseigenschaften) wirksam unterstützte. Der Gehalt der letzteren erhöhte sich um mehr als das Hundertfache, wenn sie 8 Tage lang auf einer Feederschicht aus C166-Zellen kultiviert wurden. Makrophagen, Granulozyten, Megakaryozyten, Blasten und Monozyten sowie B- und T-Lymphozyten-Vorläuferzellen wurden in gemischten Kolonien identifiziert, die auf einer Unterschicht aus C166-Zellen gewachsen waren. Dottersackzellen, die auf einer Unterschicht aus Endothelzellen wuchsen, besaßen die Fähigkeit zur Selbstreproduktion und überstanden in den Experimenten der Autoren bis zu drei Passagen. Die Wiederherstellung der Hämatopoese mit ihrer Hilfe bei reifen Mäusen mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) ging mit der Bildung aller Arten von Leukozyten sowie T- und B-Lymphozyten einher. Die Autoren verwendeten in ihren Studien jedoch Dottersackzellen eines 10 Tage alten Embryos, bei dem die extra- und intraembryonalen Gefäßsysteme bereits geschlossen sind, was das Vorhandensein intraembryonaler HSCs unter den Dottersackzellen nicht ausschließen lässt.

Gleichzeitig ergab die Analyse des Differenzierungspotenzials hämatopoetischer Zellen in frühen Entwicklungsstadien, die vor der Vereinigung der Gefäßsysteme von Dottersack und Embryo (8.–8,5. Schwangerschaftstag) isoliert wurden, das Vorhandensein von Vorläufern von T- und B-Zellen im Dottersack, jedoch nicht im Körper des Embryos. Im In-vitro-System differenzierten sich mononukleäre Zellen des Dottersacks durch die Methode der zweistufigen Kultivierung auf einer Monoschicht aus Epithel- und Subepithelzellen des Thymus in Prä-T- und reife T-Lymphozyten. Unter den gleichen Kultivierungsbedingungen, jedoch auf einer Monoschicht aus Stromazellen der Leber und des Knochenmarks, differenzierten sich mononukleäre Zellen des Dottersacks in Prä-B-Zellen und reife IglVT-B-Lymphozyten.

Die Ergebnisse dieser Studien weisen auf die Möglichkeit der Entwicklung von Immunsystemzellen aus extraembryonalem Gewebe des Dottersacks hin, und die Bildung primärer T- und B-Zelllinien hängt von Faktoren der stromalen Mikroumgebung der embryonalen hämatopoetischen Organe ab.

Andere Autoren haben ebenfalls gezeigt, dass der Dottersack Zellen mit Potenzial zur lymphatischen Differenzierung enthält und die daraus resultierenden Lymphozyten sich in ihren antigenen Eigenschaften nicht von denen geschlechtsreifer Tiere unterscheiden. Es wurde festgestellt, dass die Dottersackzellen eines 8-9 Tage alten Embryos die Lymphopoese im athymozyten Thymus wiederherstellen können, wobei reife CD3+CD4+- und CD3+CD8+-Lymphozyten mit einem gebildeten Repertoire an T-Zell-Rezeptoren entstehen. Somit kann der Thymus von Zellen extraembryonalen Ursprungs besiedelt werden, jedoch lässt sich die wahrscheinliche Migration früher T-Lymphozyten-Vorläuferzellen aus intraembryonalen Quellen der Lymphopoese in den Thymus nicht ausschließen.

Gleichzeitig führt die Transplantation hämatopoetischer Zellen aus dem Dottersack auf erwachsene bestrahlte Empfänger nicht immer zu einer langfristigen Wiederbesiedlung der dezimierten Lokalisationszonen hämatopoetischen Gewebes, und Dottersackzellen bilden in vitro deutlich weniger Milzkolonien als Zellen aus der AGM-Region. In einigen Fällen kann mit Dottersackzellen eines 9 Tage alten Embryos dennoch eine langfristige (bis zu 6 Monate) Wiederbesiedlung des hämatopoetischen Gewebes bei bestrahlten Empfängern erreicht werden. Die Autoren sind der Ansicht, dass Dottersackzellen mit dem Phänotyp CD34+c-kit+ sich in ihrer Fähigkeit zur Wiederbesiedlung dezimierter hämatopoetischer Organe nicht von denen aus der AGM-Region unterscheiden, sondern die Hämatopoese auch wirksamer wiederherstellen, da der Dottersack fast 37-mal mehr von ihnen enthält.

Es ist zu beachten, dass in den Experimenten hämatopoetische Zellen aus dem Dottersack mit Markerantigenen hämatopoetischer Stammzellen (c-kit+ und/oder CD34+ und CD38+) verwendet wurden, die den Nachkommen weiblicher Mäuse, die am 18. Tag der Schwangerschaft eine Busulfan-Injektion erhalten hatten, direkt in die Leber oder Bauchvene injiziert wurden. Bei diesen neugeborenen Tieren war die eigene Myelopoese aufgrund der durch Busulfan verursachten Eliminierung hämatopoetischer Stammzellen stark unterdrückt. Nach der Transplantation hämatopoetischer Stammzellen aus dem Dottersack wurden im peripheren Blut der Empfänger 11 Monate lang gebildete Elemente mit dem Spendermarker Glycerophosphat-Dehydrogenase nachgewiesen. Es zeigte sich, dass Dottersack-HSCs den Gehalt an Zellen lymphatischer, myeloider und erythroider Abstammungslinien in Blut, Thymus, Milz und Knochenmark wiederherstellen, und dass der Chimärismusgrad bei intrahepatischer statt intravenöser Gabe von Dottersackzellen höher war. Die Autoren sind der Ansicht, dass Dottersack-HSCs von Embryonen im Frühstadium (bis zu 10 Tage) eine vorläufige Interaktion mit dem hämatopoetischen Mikroumfeld der Leber benötigen, um die hämatopoetischen Organe erwachsener Empfänger erfolgreich zu besiedeln. Möglicherweise gibt es ein einzigartiges Entwicklungsstadium in der Embryogenese, in dem Dottersackzellen, die zunächst in die Leber wandern, dann die Fähigkeit erlangen, das Stroma der hämatopoetischen Organe reifer Empfänger zu besiedeln.

In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass nach der Transplantation von Knochenmarkszellen bei bestrahlten reifen Empfängern recht häufig eine Chimäre von Zellen des Immunsystems beobachtet wird – im Blut der letzteren finden sich Zellen des Spenderphänotyps in relativ großen Mengen unter den B-, T-Lymphozyten und Granulozyten des Empfängers, was mindestens 6 Monate anhält.

Hämatopoetische Zellen bei Säugetieren werden erstmals am 7. Tag der Embryonalentwicklung morphologisch nachgewiesen und stellen hämatopoetische Inseln in den Gefäßen des Dottersacks dar. Die natürliche hämatopoetische Differenzierung im Dottersack beschränkt sich jedoch auf primäre Erythrozyten, die Kerne behalten und fetales Hämoglobin synthetisieren. Dennoch galt traditionell die Annahme, dass der Dottersack die einzige Quelle für HSCs ist, die in die hämatopoetischen Organe des sich entwickelnden Embryos wandern und bei erwachsenen Tieren eine definitive Hämatopoese ermöglichen, da das Auftreten von HSCs im Körper des Embryos zeitgleich mit dem Verschluss der Gefäßsysteme von Dottersack und Embryo erfolgt. Diese Annahme wird durch Daten gestützt, die belegen, dass Dottersackzellen bei Klonierung in vitro zu Granulozyten und Makrophagen und in vivo zu Milzkolonien führen. Dann wurde im Verlauf von Transplantationsexperimenten festgestellt, dass die hämatopoetischen Zellen des Dottersacks, die im Dottersack selbst nur in primäre Erythrozyten differenzieren können, im Mikroumfeld der Leber neugeborener und adulter SCID-Mäuse, des depletierten Thymus oder Stroma-Feeders die Fähigkeit erlangen, hämatopoetische Organe unter Wiederherstellung aller hämatopoetischen Linien auch bei adulten Empfängertieren wieder zu besiedeln. Dies erlaubt uns im Prinzip, sie als echte HSCs zu klassifizieren – als Zellen, die in der postnatalen Phase funktionieren. Man nimmt an, dass der Dottersack zusammen mit der AGM-Region als Quelle von HSCs für die definitive Hämatopoese bei Säugetieren dient, aber ihr Beitrag zur Entwicklung des hämatopoetischen Systems ist noch unklar. Die biologische Bedeutung der Existenz zweier hämatopoetischer Organe mit ähnlichen Funktionen in der frühen Embryogenese von Säugetieren ist ebenfalls unklar.

Die Suche nach Antworten auf diese Fragen geht weiter. In vivo konnte das Vorhandensein von Zellen, die die Lymphopoese bei subletal bestrahlten SCID-Mäusen mit ausgeprägtem T- und B-Lymphozytenmangel wiederherstellen, im Dottersack von 8–8,5 Tage alten Embryonen nachgewiesen werden. Hämatopoetische Zellen aus dem Dottersack wurden sowohl intraperitoneal als auch direkt in Milz und Lebergewebe injiziert. Nach 16 Wochen wurden bei den Empfängern TCR/CD34 CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten sowie B-220+IgM+ B-Lymphozyten, markiert mit Spender-MHC-antrxgenen, nachgewiesen. Gleichzeitig fanden die Autoren im Körper der 8–8,5 Tage alten Embryonen keine Stammzellen, die zu einer solchen Wiederherstellung des Immunsystems fähig wären.

Hämatopoietische Zellen des Dottersacks besitzen ein hohes proliferatives Potenzial und sind in vitro zu einer verlängerten Selbstreproduktion fähig. Einige Autoren identifizieren diese Zellen als HSCs aufgrund der verlängerten (fast 7 Monate) Bildung erythroider Vorläuferzellen. Diese unterscheiden sich von Knochenmarksvorläuferzellen der erythroiden Linie durch eine längere Passagezeit, größere Koloniegrößen, erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Wachstumsfaktoren und längere Proliferation. Darüber hinaus werden unter geeigneten Bedingungen der Dottersackzellkultivierung in vitro auch lymphatische Vorläuferzellen gebildet.

Die präsentierten Daten lassen uns grundsätzlich den Dottersack als Quelle von HSCs betrachten, die weniger determiniert sind und daher ein größeres proliferatives Potenzial besitzen als Knochenmarksstammzellen. Obwohl der Dottersack pluripotente hämatopoetische Vorläuferzellen enthält, die in vitro über lange Zeit verschiedene Linien der hämatopoetischen Differenzierung aufrechterhalten, ist das einzige Kriterium für die Vollständigkeit von HSCs ihre Fähigkeit, die hämatopoetischen Organe des Empfängers, dessen hämatopoetische Zellen zerstört oder genetisch defekt sind, langfristig zu repopulieren. Die Schlüsselfrage ist daher, ob pluripotente hämatopoetische Zellen des Dottersacks migrieren und hämatopoetische Organe besiedeln können und ob es ratsam ist, die bekannten Arbeiten zu überarbeiten, die ihre Fähigkeit zur Repopulation der hämatopoetischen Organe erwachsener Tiere unter Bildung der wichtigsten hämatopoetischen Linien belegen. Intraembryonale Quellen definitiver GSCs wurden bereits in den 1970er Jahren in Vogelembryonen identifiziert, was bereits damals Zweifel an den etablierten Vorstellungen über den extraembryonalen Ursprung von GSCs, auch bei Vertretern anderer Wirbeltierklassen, aufkommen ließ. In den letzten Jahren erschienen Publikationen über das Vorhandensein ähnlicher intraembryonaler Bereiche mit GSCs bei Säugetieren und Menschen.

Es sei noch einmal darauf hingewiesen, dass grundlegendes Wissen auf diesem Gebiet für die praktische Zelltransplantationsforschung äußerst wichtig ist, da es nicht nur hilft, die bevorzugte Quelle von HSCs zu bestimmen, sondern auch die Besonderheiten der Interaktion primärer hämatopoetischer Zellen mit einem genetisch fremden Organismus zu ermitteln. Es ist bekannt, dass die Einführung hämatopoetischer Stammzellen aus der menschlichen fetalen Leber in einen Schafembryo im Stadium der Organogenese zur Geburt chimärer Tiere führt, in deren Blut und Knochenmark 3 bis 5 % menschlicher hämatopoetischer Zellen stabil determiniert sind. Gleichzeitig verändern menschliche HSCs ihren Karyotyp nicht und behalten eine hohe Proliferationsrate und die Fähigkeit zur Differenzierung. Darüber hinaus geraten transplantierte xenogene HSCs nicht in Konflikt mit dem Immunsystem und den Phagozyten des Wirtsorganismus und transformieren sich nicht in Tumorzellen. Dies bildete die Grundlage für die intensive Entwicklung von Methoden zur intrauterinen Korrektur erblicher genetischer Pathologien unter Verwendung von HSCs oder mit defizienten Genen transfizierten ES-SCs.

Doch in welchem Stadium der Embryogenese ist eine solche Korrektur sinnvoller? Hämatopoese-Zellen treten erstmals bei Säugetieren unmittelbar nach der Implantation (6. Tag der Trächtigkeit) auf, wenn morphologische Anzeichen hämatopoetischer Differenzierung und mutmaßliche hämatopoetische Organe noch fehlen. In diesem Stadium sind verstreute Zellen des Mausembryos in der Lage, die hämatopoetischen Organe bestrahlter Empfänger unter Bildung von Erythrozyten und Lymphozyten zu repopulieren, die sich von den Wirtszellen im Hämoglobin- bzw. Glycerophosphat-Isomerasetyp sowie in einem zusätzlichen chromosomalen Marker (Tb) der Spenderzellen unterscheiden. Bei Säugetieren wie auch bei Vögeln erscheinen hämatopoetische Zellen gleichzeitig mit dem Dottersack, vor dem Verschluss des gemeinsamen Gefäßbetts, direkt im Körper des Embryos in der paraaortischen Splanchnopleura. Hämatopoetische Zellen des Phänotyps AA4.1+ wurden aus der AGM-Region isoliert und als multipotente hämatopoetische Zellen charakterisiert, die T- und B-Lymphozyten, Granulozyten, Megakaryozyten und Makrophagen bilden. Phänotypisch ähneln diese multipotenten Vorläuferzellen sehr stark den HSCs des Knochenmarks erwachsener Tiere (CD34+c-kit+). Der Anteil multipotenter AA4.1+-Zellen an allen Zellen der AGM-Region ist gering – sie machen nicht mehr als 1/12 aus.

Im menschlichen Embryo wurde zudem eine intraembryonale Region mit HSCs identifiziert, die der AGM-Region von Tieren homolog sind. Darüber hinaus enthält der menschliche Embryokörper über 80 % multipotente Zellen mit hohem proliferativem Potenzial, obwohl solche Zellen auch im Dottersack vorkommen. Eine detaillierte Analyse ihrer Lokalisierung zeigte, dass Hunderte solcher Zellen in kompakten Gruppen gesammelt sind, die sich in unmittelbarer Nähe des Endothels der ventralen Wand der dorsalen Aorta befinden. Phänotypisch handelt es sich um CD34CD45+Lin-Zellen. Im Dottersack sowie in anderen hämatopoetischen Organen des Embryos (Leber, Knochenmark) kommen solche Zellen hingegen einzeln vor.

Folglich enthält die AGM-Region im menschlichen Embryo Cluster hämatopoetischer Zellen, die eng mit dem ventralen Endothel der dorsalen Aorta verbunden sind. Dieser Kontakt lässt sich auch auf immunchemischer Ebene verfolgen – sowohl die Zellen der hämatopoetischen Cluster als auch die Endothelzellen exprimieren den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, den Flt-3-Liganden, ihre Rezeptoren FLK-1 und STK-1 sowie den Transkriptionsfaktor von Leukämiestammzellen. In der AGM-Region werden mesenchymale Derivate durch einen dichten Strang runder Zellen repräsentiert, die sich entlang der gesamten dorsalen Aorta befinden und Tenascin C exprimieren – ein Glykoprotein der Grundsubstanz, das aktiv an den Prozessen der interzellulären Interaktion und Migration beteiligt ist.

Multipotente Stammzellen der AGM-Region stellen nach der Transplantation die Hämatopoese bei reifen bestrahlten Mäusen schnell wieder her und gewährleisten eine effektive Hämatopoese über einen langen Zeitraum (bis zu 8 Monate). Die Autoren fanden keine Zellen mit solchen Eigenschaften im Dottersack. Die Ergebnisse dieser Studie werden durch die Daten einer anderen Arbeit bestätigt, die zeigte, dass die AGM-Region in Embryonen in frühen Entwicklungsstadien (10,5 Tage) die einzige Quelle von Zellen ist, die der Definition von HSC entsprechen und die myeloide und lymphatische Hämatopoese bei reifen bestrahlten Empfängern wiederherstellen.

Die AGM-S3-Stromalinie wurde aus der AGM-Region isoliert, deren Zellen die Bildung von determinierten Vorläuferzellen CFU-GM, BFU-E, CFU-E und koloniebildenden Einheiten gemischten Typs in Kultur unterstützen. Deren Gehalt steigt während der Kultivierung auf einer Feeder-Unterschicht von AGM-S3-Linienzellen um das 10- bis 80-fache an. Somit enthält die Mikroumgebung der AGM-Region Stroma-Basiszellen, die die Hämatopoese effektiv unterstützen, sodass die AGM-Region selbst durchaus als embryonales hämatopoetisches Organ fungieren kann – eine Quelle definitiver HSCs, d. h. HSCs, die das hämatopoetische Gewebe eines erwachsenen Tieres bilden.

Eine erweiterte Immunphänotypisierung der zellulären Zusammensetzung der AGM-Region zeigte, dass diese nicht nur multipotente hämatopoetische Zellen enthält, sondern auch Zellen, die sich in myeloide und lymphatische Zellen (T- und B-Lymphozyten) differenzieren. Die molekulare Analyse einzelner CD34+c-kit+-Zellen aus der AGM-Region mittels Polymerase-Kettenreaktion zeigte jedoch nur die Aktivierung von Beta-Globin- und Myeloperoxidase-Genen, nicht jedoch von lymphatischen Genen, die für die Synthese von CD34, Thy-1 und 15 kodieren. Die partielle Aktivierung linienspezifischer Gene ist charakteristisch für frühe ontogenetische Stadien der Entstehung von HSCs und Progenitorzellen. Wenn man bedenkt, dass die Anzahl der festgelegten Vorläuferzellen in der AGM-Region eines 10 Tage alten Embryos um 2–3 Größenordnungen geringer ist als in der Leber, kann man argumentieren, dass am 10. Tag der Embryogenese die Hämatopoese in der AGM-Region gerade erst beginnt, während sich in dem wichtigsten hämatopoetischen Organ des Fötus während dieser Zeit die hämatopoetischen Linien bereits entwickelt haben.

Im Gegensatz zu früheren (9–11 Tage alten) hämatopoetischen Stammzellen des Dottersacks und der AGM-Region, die das hämatopoetische Mikromilieu des Neugeborenen, nicht aber des erwachsenen Organismus neu besiedeln, benötigen hämatopoetische Vorläuferzellen der 12–17 Tage alten embryonalen Leber kein frühes postnatales Mikromilieu mehr und besiedeln die hämatopoetischen Organe eines erwachsenen Tieres nicht schlechter als die eines Neugeborenen. Nach der Transplantation embryonaler Leber-HSCs zeigte die Hämatopoese in bestrahlten adulten Empfängermäusen polyklonalen Charakter. Darüber hinaus wurde anhand markierter Kolonien gezeigt, dass die Funktion der transplantierten Klone vollständig der im adulten Knochenmark nachgewiesenen klonalen Abfolge unterliegt. Folglich besitzen embryonale Leber-HSCs, die unter schonendsten Bedingungen und ohne Vorstimulation mit exogenen Zytokinen markiert wurden, bereits die wichtigsten Eigenschaften adulter HSCs: Sie benötigen keine frühe postembryonale Mikroumgebung, treten nach der Transplantation in einen Zustand tiefer Ruhe ein und werden gemäß dem Modell der klonalen Sukzession sequenziell zur Klonbildung mobilisiert.

Offensichtlich ist es notwendig, das Phänomen der klonalen Sukzession etwas genauer zu betrachten. Die Erythropoese wird von hämatopoetischen Stammzellen durchgeführt, die ein hohes proliferatives Potenzial und die Fähigkeit besitzen, sich in alle Linien festgelegter Vorläuferzellen von Blutzellen zu differenzieren. Bei normaler Intensität der Hämatopoese befinden sich die meisten hämatopoetischen Stammzellen in einem inaktiven Zustand und werden zur Proliferation und Differenzierung mobilisiert, wobei sie sequenziell Klone bilden, die sich gegenseitig ersetzen. Dieser Prozess wird als klonale Sukzession bezeichnet. Experimentelle Beweise für die klonale Sukzession im hämatopoetischen System wurden in Studien mit durch retroviralen Gentransfer markierten HSCs erhalten. Bei erwachsenen Tieren wird die Hämatopoese durch viele gleichzeitig funktionierende hämatopoetische Klone, Derivate von HSCs, aufrechterhalten. Basierend auf dem Phänomen der klonalen Sukzession wurde ein Repopulationsansatz zur Identifizierung von HSCs entwickelt. Nach diesem Prinzip unterscheidet man zwischen langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSC), die in der Lage sind, das blutbildende System lebenslang wiederherzustellen, und kurzfristigen HSC, die diese Funktion für einen begrenzten Zeitraum erfüllen.

Wenn wir hämatopoetische Stammzellen aus der Sicht des Repopulationsansatzes betrachten, dann ist die Besonderheit der hämatopoetischen Zellen der embryonalen Leber ihre Fähigkeit, Kolonien zu bilden, die deutlich größer sind als die in den gewachsenen HSCs aus Nabelschnurblut oder Knochenmark, und dies gilt für alle Arten von Kolonien. Diese Tatsache allein weist auf ein höheres proliferatives Potenzial der hämatopoetischen Zellen der embryonalen Leber hin. Eine einzigartige Eigenschaft hämatopoetischer Vorläuferzellen der embryonalen Leber ist ein kürzerer Zellzyklus im Vergleich zu anderen Quellen, was im Hinblick auf die Effektivität der Repopulation hämatopoetischer Organe während einer Transplantation von großer Bedeutung ist. Die Analyse der Zellzusammensetzung der hämatopoetischen Suspension, die aus Quellen eines reifen Organismus gewonnen wurde, weist darauf hin, dass in allen Stadien der Ontogenese Kernzellen überwiegend durch endgültig differenzierte Zellen repräsentiert werden, deren Anzahl und Phänotyp vom ontogenetischen Alter des Spenders des hämatopoetischen Gewebes abhängen. Insbesondere Suspensionen mononukleärer Zellen aus Knochenmark und Nabelschnurblut bestehen zu über 50 % aus reifen Zellen der lymphatischen Reihe, während das hämatopoetische Gewebe der embryonalen Leber weniger als 10 % Lymphozyten enthält. Darüber hinaus werden die Zellen der myeloiden Linie in der embryonalen und fetalen Leber hauptsächlich durch die erythroide Reihe repräsentiert, während in Nabelschnurblut und Knochenmark Granulozyten-Makrophagen-Elemente vorherrschen.

Wichtig ist auch, dass die embryonale Leber einen vollständigen Satz der frühesten hämatopoetischen Vorläuferzellen enthält. Zu letzteren zählen erythroide, granulopoetische, megakaryopoetische und multilineare koloniebildende Zellen. Ihre primitiveren Vorläuferzellen – LTC-IC – können sich in vitro fünf Wochen oder länger vermehren und differenzieren und behalten auch nach der Transplantation im Empfängerkörper während allogener und sogar xenogener Transplantationen bei immundefizienten Tieren ihre funktionelle Aktivität.

Die biologische Zweckmäßigkeit der Dominanz erythroider Zellen in der embryonalen Leber (bis zu 90 % der Gesamtzahl der hämatopoetischen Elemente) beruht auf der Notwendigkeit, das schnell wachsende Blutvolumen des sich entwickelnden Fötus mit Erythrozytenmasse zu versorgen. In der embryonalen Leber wird die Erythropoese durch nukleäre erythroide Vorläufer unterschiedlichen Reifegrades repräsentiert, die fetales Hämoglobin (a2u7) enthalten, das aufgrund seiner höheren Affinität zu Sauerstoff eine effektive Aufnahme des Sauerstoffs aus dem mütterlichen Blut gewährleistet. Die Intensivierung der Erythropoese in der embryonalen Leber ist mit einer lokalen Erhöhung der Erythropoietin-Synthese (EPO) verbunden. Es ist bemerkenswert, dass die Anwesenheit von Erythropoietin allein für die Realisierung des hämatopoetischen Potenzials hämatopoetischer Zellen in der embryonalen Leber ausreicht, während für die Bindung von Knochenmark- und Nabelschnurblut-HSCs an die Erythropoese eine Kombination aus Zytokinen und Wachstumsfaktoren bestehend aus EPO, SCF, GM-CSF und IL-3 erforderlich ist. Gleichzeitig reagieren frühe hämatopoetische Vorläuferzellen aus der embryonalen Leber, die keine Rezeptoren für EPO besitzen, nicht auf exogenes Erythropoietin. Für die Induktion der Erythropoese in einer Suspension mononukleärer Zellen der embryonalen Leber ist die Anwesenheit weiter fortgeschrittener Erythropoietin-sensitiver Zellen mit dem Phänotyp CD34+CD38+, die den EPO-Rezeptor exprimieren, notwendig.

In der Literatur besteht noch kein Konsens über die Entwicklung der Hämatopoese in der Embryonalperiode. Die funktionelle Bedeutung der Existenz extra- und intraembryonaler Quellen hämatopoetischer Vorläuferzellen ist nicht geklärt. Es besteht jedoch kein Zweifel daran, dass die Leber in der menschlichen Embryogenese das zentrale Organ der Hämatopoese ist und in der 6. bis 12. Schwangerschaftswoche als Hauptquelle hämatopoetischer Stammzellen dient, die Milz, Thymus und Knochenmark besiedeln. DDRs gewährleisten die Erfüllung der entsprechenden Funktionen in der prä- und postnatalen Entwicklungsphase.

Es sei noch einmal darauf hingewiesen, dass die embryonale Leber im Vergleich zu anderen Quellen den höchsten Gehalt an HSCs aufweist. Etwa 30 % der CD344-Zellen der embryonalen Leber haben den CD38-Phänotyp. Gleichzeitig beträgt die Anzahl lymphatischer Vorläuferzellen (CD45+) in den frühen Stadien der Hämatopoese in der Leber nicht mehr als 4 %. Es wurde festgestellt, dass während der Entwicklung des Fötus zwischen der 7. und 17. Schwangerschaftswoche die Anzahl der B-Lymphozyten progressiv um monatlich 1,1 % zunimmt, während der HSC-Spiegel dauerhaft abnimmt.

Die funktionelle Aktivität hämatopoetischer Stammzellen hängt auch von der Phase der embryonalen Entwicklung ihrer Quelle ab. Die Untersuchung der koloniebildenden Aktivität von Leberzellen menschlicher Embryonen in der 6.–8. und 9.–12. Schwangerschaftswoche während der Kultivierung in einem halbflüssigen Medium in Gegenwart von SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 und EPO hat gezeigt, dass die Gesamtzahl der Kolonien 1,5-mal höher ist, wenn HSCs aus embryonaler Leber in frühen Entwicklungsstadien ausgesät werden. Gleichzeitig ist die Zahl myelopoetischer Vorläuferzellen wie CFU-GEMM in der Leber in der 6.–8. Woche der Embryogenese mehr als dreimal höher als in der 9.–12. Schwangerschaftswoche. Generell war die koloniebildende Aktivität hämatopoetischer Leberzellen von Embryonen im ersten Schwangerschaftstrimester signifikant höher als die fötaler Leberzellen im zweiten Schwangerschaftstrimester.

Die obigen Daten deuten darauf hin, dass sich die embryonale Leber zu Beginn der Embryogenese nicht nur durch einen erhöhten Gehalt an frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen auszeichnet, sondern dass ihre hämatopoetischen Zellen auch ein breiteres Spektrum der Differenzierung in verschiedene Zelllinien aufweisen. Diese Merkmale der funktionellen Aktivität hämatopoetischer Stammzellen der embryonalen Leber können eine gewisse klinische Bedeutung haben, da ihre qualitativen Eigenschaften einen ausgeprägten therapeutischen Effekt bereits bei der Transplantation einer kleinen Anzahl von Zellen aus frühen Stadien der Schwangerschaft erwarten lassen.

Dennoch bleibt das Problem der für eine wirksame Transplantation erforderlichen Menge hämatopoetischer Stammzellen offen und relevant. Es wird versucht, dieses Problem zu lösen, indem das hohe Selbstreproduktionspotenzial hämatopoetischer Zellen der embryonalen Leber in vitro nach Stimulation durch Zytokine und Wachstumsfaktoren genutzt wird. Durch konstante Perfusion früher embryonaler Leber-HSCs in einem Bioreaktor kann nach 2–3 Tagen eine 15-mal höhere Menge hämatopoetischer Stammzellen gewonnen werden. Zum Vergleich: Unter denselben Bedingungen dauert es mindestens zwei Wochen, um die Produktion menschlicher Nabelschnurblut-HSCs um das 20-fache zu steigern.

Somit unterscheidet sich die embryonale Leber von anderen Quellen hämatopoetischer Stammzellen durch einen höheren Gehalt sowohl an determinierten als auch an frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen. In der Kultur mit Wachstumsfaktoren bilden embryonale Leberzellen mit dem Phänotyp CD34+CD45Ra1 CD71l0W 30-mal mehr Kolonien als ähnliche Nabelschnurblutzellen und 90-mal mehr als Knochenmark-HSCs. Die ausgeprägtesten Unterschiede bei den genannten Quellen liegen im Gehalt an frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen, die gemischte Kolonien bilden – die Menge an CFU-GEMM in der embryonalen Leber übersteigt die in Nabelschnurblut und Knochenmark um das 60- bzw. 250-Fache.

Wichtig ist auch, dass bis zur 18. Woche der Embryonalentwicklung (dem Zeitraum des Beginns der Hämatopoese im Knochenmark) mehr als 60 % der Leberzellen an der Umsetzung der hämatopoetischen Funktion beteiligt sind. Da der menschliche Fötus bis zur 13. Entwicklungswoche keinen Thymus und dementsprechend keine Thymozyten besitzt, reduziert die Transplantation hämatopoetischer Zellen aus der embryonalen Leber der 6.-12. Schwangerschaftswoche das Risiko einer „Graft-versus-Host“-Reaktion erheblich und erfordert nicht die Auswahl eines histokompatiblen Spenders, da so relativ einfach eine hämatopoetische Chimäre erreicht werden kann.