Immunologische Studien in der Urologie

Die Verschreibung eines Immunogramms bei einem urologischen Patienten bedeutet, dass der behandelnde Arzt Störungen des Immunsystems vermutet. Wiederkehrende bakterielle, virale und Pilzinfektionen, allergische Manifestationen sowie systemische Erkrankungen können Anzeichen dieser Erkrankungen sein, die durch eine Reihe von Syndromen (infektiös, onkologisch, allergisch, autoimmun, lymphoproliferativ) gekennzeichnet sind. Ein Patient kann mehrere Syndrome aufweisen. Beispielsweise können chronische Infektionskrankheiten (infektiöses Syndrom) eine Immunschwäche verursachen, und eine Immunschwäche kann sich als Prädisposition für Infektions- und onkologische Erkrankungen (onkologisches Syndrom) manifestieren. Eine Prädisposition für Infektionen kann vor dem Hintergrund einer sekundären Immunschwäche auftreten, die sich als Folge einer lymphoproliferativen Erkrankung wie Leukämie entwickelt hat. Es gibt drei Hauptgruppen pathologischer Veränderungen des Immunsystems:

• quantitativer oder funktioneller Mangel des einen oder anderen Glieds des Immunsystems, der zur Entwicklung eines Immunschwächezustands führt;
• eine Störung der Antigenerkennung durch das Immunsystem, die zur Entwicklung von Autoimmunprozessen führt;
• eine hyperreaktive oder „perverse“ Immunreaktion, die sich in der Entwicklung allergischer Erkrankungen äußert.

Es gibt Screening- (Level-1-Tests) und Klärungsmethoden (Level-2-Tests) der Immundiagnostik. Erstere dienen dazu, Störungen des Immunsystems zu erfassen, letztere dazu, die Mechanismen ihrer Umsetzung zum Zwecke einer weiteren Immunkorrektur zu ermitteln.

B-Zell-Immunität

Screening-Methoden

• Bestimmung der relativen und absoluten Anzahl von B-Lymphozyten mittels Immunfluoreszenz oder Durchflusszytofluorometrie mit monoklonalen Antikörpern gegen B-Zell-Antigene (CD19, CD20, wobei CD Differenzierungscluster bezeichnet). Der normale B-Lymphozytengehalt bei Erwachsenen beträgt 8–19 % der Gesamtleukozytenzahl bzw. 190–380 Zellen/µl. Ein erhöhter B-Lymphozytengehalt tritt bei akuten und chronischen bakteriellen und Pilzinfektionen, chronischen Lebererkrankungen, systemischen Bindegewebserkrankungen, chronischer lymphatischer Leukämie und Myelom auf.
• Bestimmung der Konzentration unspezifischer Immunglobuline (F, M, G, E) durch einfache radiale Immundiffusion, Nephelometrie oder Turbometrie, Radioimmunoassay oder Enzymimmunoassay (ELISA). Normen für Erwachsene: Immunglobulin (Ig) A 0,9–4,5 g / l. IgM 03–3,7 g / l. IgG 8,0–17 g / l. Ein Anstieg der Immunglobulinkonzentration tritt unter denselben pathologischen Zuständen auf, unter denen ein Anstieg des B-Lymphozytengehalts auftritt. Eine Abnahme der Immunglobulinkonzentration tritt bei angeborener Hypogammaglobulinämie, Neoplasien des Immunsystems, Milzentfernung, Proteinverlust, Nieren- oder Darmerkrankungen sowie Behandlung mit Zytostatika und Immunsuppressiva auf.

Klärende Methoden

• Bestimmung zirkulierender Immunkomplexe im Blut durch selektive Fällung in Polyethylenglykol mit anschließender spektrophotometrischer Dichtemessung (Normalwert 80–20 U). Eine Zunahme zirkulierender Immunkomplexe ist typisch für akute bakterielle, Pilz- und Virusinfektionen, Autoimmunerkrankungen, Immunkomplexerkrankungen, Serumkrankheit und allergische Reaktionen vom Typ 3.
• Bestimmung spezifischer Immunglobuline im Blut in Bezug auf bakterielle und virale Antigene, Desoxyribonukleinsäure (DNA) bei Autoimmunerkrankungen, Nachweis von Antispermien (Autoimmuninfertilität) und antirenalen Antikörpern (Pyelonephritis und Glomerulonephritis) mittels radialer Immundiffusion oder ELISA-Methode.
• Bestimmung von Anti-Spermien-Antikörpern im Sperma [MAR-Test (gemischte Antiglobulinreaktion)], normales - negatives Ergebnis.
• Bestimmung der Konzentration von Immunglobulinen im Urin zum Zwecke der Differentialdiagnose zwischen Pyelonephritis und Glomerulonephritis (Selektivität der Proteinurie).
• Bestimmung des IgE-Gehalts im Prostatasaft zur Diagnose einer allergischen Prostatitis mittels radialer Immundiffusionsmethode oder ELISA.
• Untersuchung der Reaktion der B-Lymphozyten-Blastentransformation auf B-Zell-Mitogen (Kermesbeeren-Mitogen zur Stimulation der Reaktion der B-Lymphozyten-Blastentransformation in Gegenwart von T-Lymphozyten), deren Normwert 95–100 % beträgt.

T-Zell-Verbindung der Immunität

Screening-Methoden

• Bestimmung der relativen und absoluten Anzahl reifer CD3-T-Lymphozyten durch Immunfluoreszenzreaktion oder Durchflusszytofluorometrie unter Verwendung monoklonaler Anti-CD3-Antikörper. Die Norm für Erwachsene liegt bei 58–76 % oder 1100–1700 Zellen/µl. Eine Abnahme der T-Lymphozytenzahl ist ein Indikator für eine Insuffizienz des zellulären Immunmechanismus. Dies ist typisch für einige sekundäre und primäre Immundefekte (chronische bakterielle und virale Infektionen: Tuberkulose, erworbenes Immunschwächesyndrom, bösartige Tumoren, chronisches Nierenversagen, Verletzungen, Stress, Alterung, Unterernährung, Behandlung mit Zytostatika, Exposition gegenüber ionisierender Strahlung). Eine Zunahme der T-Lymphozytenzahl tritt vor dem Hintergrund einer Immunhyperaktivität oder bei lymphoproliferativen Erkrankungen auf. Bei einer Entzündung nimmt die Zahl der T-Lymphozyten zunächst zu und dann ab. Das Ausbleiben einer Abnahme der T-Lymphozyten weist auf einen chronischen Entzündungsprozess hin.
• Auswertung von Lymphozyten-Subpopulationen.
  • Bestimmung der Anzahl der T-Helferzellen (Anti-CD4-Antikörper). Normalerweise 36–55 % oder 400–1100 Zellen/µl. Eine Zunahme dieser Zellen tritt bei Autoimmunerkrankungen, Morbus Waldenström und Aktivierung der Transplantationsimmunität auf; eine Abnahme der T-Helferzellen tritt bei chronischen bakteriellen, viralen und protozoischen Infektionen, Tuberkulose, erworbenem Immunschwächesyndrom, bösartigen Tumoren, Verbrennungen, Verletzungen, Unterernährung, Alterung, Behandlung mit Zytostatika und Exposition gegenüber ionisierender Strahlung auf.
  • Bestimmung der Anzahl der T-Suppressoren (Anti-CD4-Antikörper). Normalerweise 17–37 % oder 300–700 Zellen/µl. Eine Zunahme der T-Suppressoren tritt unter denselben Bedingungen auf, unter denen die Anzahl der T-Helferzellen abnimmt, und ihre Abnahme tritt unter denselben Bedingungen auf, unter denen der Gehalt an T-Helferzellen zunimmt.
  • Immunregulatorischer Index CD4/CD8, normalerweise 1,5–2,5. Hyperaktivität mit Werten über 2,5 (allergische und Autoimmunerkrankungen); Hypoaktivität – weniger als 1,0 (Anfälligkeit für chronische Infektionen). Zu Beginn des Entzündungsprozesses steigt der immunregulatorische Index an und normalisiert sich nach dessen Abklingen.

Klärende Methoden

• Bestimmung der Anzahl natürlicher Killerzellen (NK-Zellen) – Anti-CD16- und Anti-CD56-Antikörper. Die Norm für CD16-Lymphozyten beträgt 6–26 %, für CD56 9–19 %. Eine Zunahme der NK-Zellen tritt bei Transplantatabstoßung auf, eine Abnahme bei Virusinfektionen, Krebs, primären und sekundären Immundefekten, Verbrennungen, Verletzungen und Stress, Behandlung mit Zytostatika und Exposition gegenüber ionisierender Strahlung.
• Bestimmung der Anzahl von T-Lymphozyten mit einem Rezeptor für Interleukin-2 (Aktivierungsmarker) – Anti-CD25-Antikörper. Die Norm liegt bei 10–15 %. Eine Zunahme ihrer Anzahl wird bei allergischen Erkrankungen, Transplantatabstoßung, Reaktion auf Thymus-abhängige Antigene in der akuten Phase der Primärinfektion beobachtet, eine Abnahme – bei denselben Erkrankungen, bei denen die Anzahl der NK-Zellen abnimmt.
• Untersuchung der Expression des Aktivierungsmarkers – Histokompatibilitätsmolekül der Klasse II HLA-DR. Eine erhöhte Expression tritt bei entzündlichen Prozessen, bei Patienten mit Hepatitis C, Zöliakie, Syphilis und akuten Atemwegserkrankungen auf.
• Bewertung der Apoptose von Lymphozyten. Eine grobe Vorstellung von der Apoptosebereitschaft von Lymphozyten kann durch die Expression des Fas-Rezeptors (CD95) auf ihrer Oberfläche und des bd-2-Proto-Onkogens in den Mitochondrien gewonnen werden. Die Apoptose von Lymphozyten wird durch die Behandlung mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen beurteilt: Propidiumiodid, das an DNA-Fragmente bindet, und Annexin Y, das an Phosphatidylserin bindet, das zu Beginn der Apoptose auf der Zellmembran erscheint. Die Ergebnisse werden mit einem Durchflusszytofluorometer ausgewertet. Die Ergebnisse werden anhand des Verhältnisses der mit verschiedenen Farbstoffen gefärbten Zellen berechnet. Ungefärbte Zellen sind lebensfähig, Zellen, die nur an Annexin Y gebunden sind, stellen frühe Manifestationen der Apoptose dar, Zellen mit Propidiumiodid und Annexin Y stellen späte Manifestationen der Apoptose dar, eine Färbung mit nur Propidiumiodid weist auf Nekrose hin.
• Bewertung der T-Lymphozytenproliferation in vitro.
  • Veränderungen in der Zellblastogenese – Blastentransformationsreaktion von Lymphozyten. Leukozyten werden mit beliebigen Mitogenen pflanzlichen Ursprungs (Lektinen) inkubiert. Phytohämagglutinin wird meist 72 Stunden lang angewendet, anschließend wird ein Ausstrich entnommen, gefärbt und die Blastenanzahl gezählt! Der Stimulationsindex ist das Verhältnis des Anteils transformierter Zellen im Experiment (Kultur mit Phytohämagglutinin) zum Anteil transformierter Zellen in der Kontrolle (Kultur ohne Phytohämagglutinin). Die Blastentransformationsreaktion von Lymphozyten kann durch die Zugabe eines radioaktiven Markers (ZN-Thymndinum) zu den kultivierten Zellen beurteilt werden, da die DNA-Synthese während der Zellteilung zunimmt. Störungen der proliferativen Reaktion treten sowohl bei primären als auch bei sekundären Immundefekten auf, die mit Infektionen, Krebs, Nierenversagen und chirurgischen Eingriffen einhergehen.
  • In diesen Studien wird die Expression von Aktivierungsmarkern (CD25, Transferrinrezeptor - CD71) und des Moleküls des Haupthistokompatibilitätskomplexes Klasse II HLA-DR bewertet, die auf ruhenden T-Lymphozyten praktisch nicht vorhanden sind. T-Lymphozyten werden mit Phytohämagglutinin stimuliert, nach 3 Tagen wird die Expression von Aktivierungsmarkern mit der Methode der direkten oder indirekten Immunfluoreszenzreaktion, Durchflusszytofluorometrie, unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen die isolierten Rezeptoren analysiert.
  • Messung der Menge der von aktivierten T-Lymphozyten synthetisierten Mediatoren [Interleukin (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-Interferon usw.] mittels Radioimmunoassay oder ELISA. Besonders wichtig ist die Bestimmung der Konzentration von γ-Interferon und IL-4 als Marker für Th1 und Th2 im Überstand aktivierter Kulturen und innerhalb der Zelle. Wenn möglich, ist es sinnvoll, die Genexpression für das entsprechende Zytokin anhand des Matrix-Ribonukleinsäure-Spiegels in der Produzentenzelle und der Expressionsintensität der Rezeptoren für die entsprechenden Zytokine zu bestimmen.
    
• Hemmreaktion der Lymphozytenmigration. Sensibilisierte T-Lymphozyten sezernieren in Reaktion auf Antigene Lymphokine, darunter Faktoren, die die Lymphozytenmigration hemmen. Das Hemmphänomen wird beobachtet, wenn Mitogene in die Zellkultur eingeführt werden. Die Bestimmung des Hemmungsgrades ermöglicht die Beurteilung der Fähigkeit der Lymphozyten, Zytokine zu sezernieren. Normalerweise beträgt die Migrationsfrequenz, abhängig vom spezifischen Mitogen, 20–80 %.
• Bewertung der NK-Zell-Zytotoxizität. Die Fähigkeit natürlicher Killerzellen, Zielzellen der Erythromyeloiden Linie K-562 abzutöten, wird bestimmt. Zur Bewertung der antikörperabhängigen Zytotoxizität werden mit IgG-Antikörpern beschichtete Zielzellen verwendet. Die Zielzellen werden mit 3H-Uridin markiert und mit Effektorzellen inkubiert. Der Tod der Zielzellen wird durch die Freisetzung der radioaktiven Markierung in die Lösung beurteilt. Bei malignen Neoplasien tritt eine Abnahme der Zytotoxizität auf. In einigen Fällen, wenn die Wirksamkeit einer Behandlung mit Interleukinen vorhergesagt werden muss, wird die Zytotoxizität von NK-Zellen während der Inkubation mit bestimmten Zytokinen bewertet.

Untersuchung der Phagozytenfunktion

Screening-Methoden

Untersuchung der Absorptionsintensität mikrobieller Zellen durch Phagozyten (Phagozytose von Latexpartikeln, Testkultur von Staphylokokken, E. coli oder vom Patienten isolierten Mikroorganismen). Durch Zentrifugieren von heparinisiertem Blut wird eine Leukozytensuspension isoliert, Serum der Blutgruppe IV wird zur Opsonisierung hinzugefügt (Opsonine sind Proteine, die die Phagozytose verstärken). Die mikrobielle Suspension wird verdünnt, mit Leukozyten vermischt und 120 Minuten inkubiert. 30,90,120 Minuten nach Beginn der Inkubation werden Proben zur Analyse entnommen. Aus der gesammelten Leukozytensuspension werden Abstriche angefertigt. Folgende Phagozytoseindikatoren werden bestimmt:

• Phagozytoseindex – der Prozentsatz der Zellen, die innerhalb von 30 Minuten und 120 Minuten Inkubation in die Phagozytose eingetreten sind; der Standardwert des Phagozytoseindex (30) beträgt 94 %, der Phagozytoseindex (120) beträgt 92 %;
• Phagozytenzahl – die durchschnittliche Anzahl intrazellulär lokalisierter Bakterien; der Standardwert der Phagozytenzahl (30) beträgt 11 %, die Phagozytenzahl (120) beträgt 9,8 %;
• Phagozytenzahlkoeffizient – das Verhältnis der Phagozytenzahl (30) zur Phagozytenzahl (120); normalerweise 1,16;
• Neutrophilen-Bakterizidieindex – das Verhältnis der Anzahl der in Phagozyten abgetöteten Mikroben zur Gesamtzahl der absorbierten Mikroben; normalerweise 66 %.

Klärende Methoden

• Untersuchung der bakteriziden Wirkung von Phagozyten im Test mit Nitroblautetrazolium (NBT) – NBT-Test. Leukozyten werden mit gelbem Nitroblautetrazolium-Farbstoff versetzt. Wenn ein Neutrophiler den Farbstoff aufnimmt, tritt unter dem Einfluss von freien Sauerstoffradikalen ein Reduktionsprozess ein, der eine Blaufärbung zur Folge hat. Die Reaktion wird in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden durchgeführt. Den ersten drei Wells mit einer Mischung aus NBT und Leukozyten wird Hanks-Lösung (spontanes NBT) hinzugefügt, dem zweiten Well werden Latexpartikel hinzugefügt; das Gemisch wird 25 min bei 37 °C inkubiert. Die Ergebnisse werden bei 540 nm auf einem Lesegerät abgelesen und in willkürlichen Einheiten ausgedrückt. Der Stimulationskoeffizient (K _st ) wird berechnet, er ist das Verhältnis der optischen Dichte in den stimulierten Wells zur durchschnittlichen optischen Dichte in den Wells ohne Stimulation. Bei gesunden Menschen beträgt NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Untersuchung von Adhäsionsmolekülen. Die Durchflusszytofluorometrie dient zur Bestimmung der Expression der Oberflächenantigene CD11a/CD18, CD11b/CD18 und CD11c/CD18. Immundefekte mit gestörter Adhäsion äußern sich in wiederkehrenden Infektionen, langsamer Wundheilung und dem Fehlen von Eiter in den Infektionsherden.

Untersuchung des Komplementsystems

Screening-Methoden

Die Bestimmung der hämolytischen Aktivität des Komplementsystems ist eine Untersuchung des klassischen Weges der Komplementaktivierung. Zu mit Antikörpern beschichteten Erythrozyten des Widders werden verschiedene Serumverdünnungen von kranken und gesunden Personen hinzugefügt. Die Einheit der hämolytischen Aktivität ist der Kehrwert der Serumverdünnung, bei der 50 % der Erythrozyten zerstört sind. Der Hämolysegrad wird photometrisch anhand der Hämoglobinfreisetzung in die Lösung bestimmt. Eine verminderte hämolytische Aktivität des Komplementsystems wird bei systemischem Lupus erythematodes mit Nierenschäden, akuter Glomerulonephritis, kombinierten Immundefekten, Myasthenie, Virushepatitis und Lymphomen beobachtet, eine erhöhte Aktivität bei obstruktiver Gelbsucht, Hashimoto-Thyreoiditis, Rheuma, rheumatoider Arthritis, nodulärer Periarteriitis, Dermatomyositis, Myokardinfarkt, Colitis ulcerosa, Reiter-Syndrom und Gicht.

Klärende Methoden

• Bestimmung der Komplementkomponenten. Die quantitative Bestimmung erfolgt mittels radialer Immundiffusion und Nephelometrie.
  Die Untersuchung ist nur dann aussagekräftig, wenn die antigenen Eigenschaften der Komplementkomponenten verändert werden.
• Es wurde festgestellt, dass die Clq-Komponente des Komplements die Phagozytose verstärkt und die zelluläre Zytotoxizität vermittelt. Ihre Abnahme tritt bei Immunkomplexerkrankungen, systemischem Lupus erythematodes, eitrigen Infektionen und Tumoren auf.
• Die C3-Komponente ist an der Aktivierung der klassischen und alternativen Komplementwege beteiligt. Eine Abnahme ihrer Konzentration ist mit chronischen bakteriellen und Pilzinfektionen sowie dem Vorhandensein zirkulierender oder Gewebeimmunkomplexe verbunden.
• Die C4-Komponente ist an der Aktivierung des klassischen Komplementweges beteiligt. Eine Abnahme ihrer Konzentration ist mit einer verlängerten Aktivierung des Komplementsystems durch Immunkomplexe und einer Abnahme der Konzentration des C1-Inhibitors verbunden, der die Aktivierung des klassischen Komplementweges steuert. Ein C4-Mangel tritt bei systemischem Lupus erythematodes auf, ein Anstieg von C4 tritt bei Nierenerkrankungen, Transplantatabstoßung, akuten Entzündungen und Magen-Darm-Erkrankungen auf.
• C5a ist ein kleines Fragment des C5-Moleküls, das durch die Aktivierung des Komplementsystems von diesem abgespalten wird. Seine Konzentration steigt bei Entzündungen, Sepsis, atopischen und allergischen Erkrankungen an.
• Der Cl-Inhibitor ist ein multifunktionaler Faktor. Er steuert die Aktivierung der Komplementkomponente C1, hemmt die Aktivität von Kallikrein, Plasmin und aktiviertem Hageman-Faktor sowie Cls- und Or-Proteasen. Ein Mangel an C1-Inhibitor führt zu Angioödemen.
• Funktionsstudien des Komplements. Das Testserum wird einem Standardserum ohne Komplementkomponente zugesetzt und die hämolytische Aktivität des Komplements bestimmt. Wenn sich die hämolytische Aktivität nicht normalisiert, gilt die Aktivität dieser Komplementkomponente im Testserum als reduziert.

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