Labordiagnose der Tuberkulose

Tuberkulose ist eine Krankheit, die unter modernen Bedingungen und wissenschaftlichen Errungenschaften leicht zu diagnostizieren ist. Die Labordiagnostik der Tuberkulose nimmt neben der Röntgenuntersuchung einen zentralen Platz unter anderen Diagnosemethoden ein.

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Klinischer Bluttest

Bei Patienten mit Tuberkulose sind Veränderungen im allgemeinen Bluttest nicht pathognomonisch. Bei begrenzten und niedrigaktiven Formen der Tuberkulose ist eine Hypochromie der Erythrozyten mit normaler Anzahl charakteristisch. Bei massiven Infiltraten oder käsiger Pneumonie, mit ausgedehnter käsiger Lymphadenitis, spezifischen Darmschäden sowie bei großen Lungen- oder postoperativen Blutungen werden Erythropenie und Mikrozytose, Oligochromasie und Polychromasie festgestellt. Makrozytose und insbesondere Poikilozytose treten viel seltener auf, meist bei schwerer Anämie. Die Anzahl der Retikulozyten im kompensierten Stadium der Tuberkulose variiert zwischen 0,1 und 0,6 %, im subkompensierten Stadium zwischen 0,6 und 1,0 %, und für das dekompensierte Stadium sind 1 % Retikulozyten charakteristisch.

In einigen Fällen von Tuberkulose kann eine mäßige Leukozytose (bis zu 15.000 Leukozyten) beobachtet werden, seltener eine Leukopenie, die bei Patienten mit begrenzten und leichten Formen des Prozesses in 2-7 % der Fälle und bei destruktiver und fortschreitender Lungentuberkulose in 12,5 % der Fälle auftritt.

Am häufigsten treten Verschiebungen in der Leukozytenformel auf. Es wird sowohl eine relative als auch eine absolute Neutrophilie beobachtet, eine moderate Verschiebung der Leukozytenformel nach links zu den Promyelozyten. Myelozyten sind bei unkomplizierter Tuberkulose sehr selten. Ein Anstieg der Anzahl von Neutrophilen mit pathologischer Granularität im Blutbild eines Tuberkulosepatienten weist immer auf die Dauer des Prozesses hin: Bei Patienten mit schwerer Tuberkulose weisen fast alle Neutrophilen eine pathologische Granularität auf. Nach Abklingen eines Tuberkuloseausbruchs normalisiert sich die Kernverschiebung relativ schnell. Die pathologische Granularität der Neutrophilen bleibt in der Regel länger bestehen als andere Veränderungen im Blutbild.

Der Gehalt an Eosinophilen im peripheren Blut schwankt ebenfalls in Abhängigkeit von der Phase des Prozesses und dem allergischen Zustand des Organismus. Ihre Zahl nimmt bei schweren und langwierigen Krankheitsausbrüchen bis zur Aneosinophilie ab und steigt umgekehrt bei der Resorption von Infiltraten und Pleuraergüssen sowie bei frühen Formen der primären Tuberkulose an.

Die meisten Formen der primären Tuberkulose gehen mit einer Lymphopenie einher, die manchmal auch nach der Vernarbung bestimmter Veränderungen noch mehrere Jahre anhält. Sekundäre Tuberkulose in der akuten Phase kann je nach Schwere des Prozesses entweder mit einer normalen Lymphozytenzahl oder einer Lymphopenie einhergehen.

Unter den Tests zur Beurteilung des Tuberkuloseprozesses nimmt die Bestimmung der Erythrozytensedimentationsrate (BSG) einen besonderen Platz ein, die für die Beurteilung des Tuberkuloseverlaufs und die Identifizierung seiner aktiven Formen wichtig ist. Ein Anstieg der BSG weist auf einen pathologischen Prozess (infektiös-entzündlich, eitrig, septisch, Hämoblastose, Lymphogranulomatose usw.) hin und dient als Indikator für dessen Schweregrad. Normale BSG-Werte weisen jedoch nicht immer auf das Fehlen einer Pathologie hin. Die Beschleunigung der Erythrozytensedimentation wird durch einen Anstieg des Globulin-, Fibrinogen- und Cholesteringehalts im Blut sowie eine Abnahme der Blutviskosität erleichtert. Eine Verlangsamung der Erythrozytensedimentation ist charakteristisch für Zustände, die mit Hämokonzentration, einem Anstieg des Albumin- und Gallensäuregehalts einhergehen.

Das Blutbild von Tuberkulosepatienten verändert sich während der Behandlung. Je erfolgreicher die therapeutische Intervention, desto schneller verschwinden die hämatologischen Veränderungen. Gleichzeitig sollte die Wirkung verschiedener antibakterieller Medikamente auf die Hämatopoese berücksichtigt werden. Sie verursachen häufig Eosinophilie, in manchen Fällen Leukozytose und häufiger Leukopenie bis hin zu Agranulozytose und lymphoid-retikulärer Reaktion. Eine systematische hämatologische Überwachung und eine korrekte Analyse der gewonnenen Daten sind unerlässlich, um den klinischen Zustand des Patienten, die Prozessdynamik und die Wirksamkeit der Behandlung zu beurteilen.

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Klinische Urinanalyse

Bei einer Harnwegstuberkulose ist die Urinanalyse die wichtigste Labordiagnostikmethode. Es können Leukozyturie, Erythrozyturie, Proteinurie, Hypoisosthenurie, tuberkulöse Mykobakteriurie und unspezifische Bakteriurie auftreten.

Leukozyturie ist das häufigste Symptom einer Harnwegstuberkulose vor einer spezifischen Chemotherapie und fehlt nur in Ausnahmefällen, beispielsweise bei vollständiger Obliteration des Harnleiterlumens. Der Nechiporenko-Test (Bestimmung der Leukozytenzahl in 1 ml Urin) hilft, den Grad der Leukozyturie bei Nephrotuberkulose objektiver zu beurteilen und in einigen Fällen mit einer normalen allgemeinen Urinanalyse nachzuweisen. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass Leukozyturie bei akuter und chronischer Pyelonephritis, Blasenentzündung, Urethritis, Nierensteinen und Harnleitern auftreten kann.

Erythrozyturie gilt wie Leukozyturie als eines der häufigsten Laborsymptome der Urogenitaltuberkulose. Die Häufigkeit der Hämaturie hängt von der Prävalenz des Prozesses ab und nimmt mit der Entwicklung des destruktiven tuberkulösen Prozesses in der Niere zu. Erythrozyturie ohne Leukozyturie ist typischer für die frühen Stadien der Nierentuberkulose. Die gegenüber der Leukozyturie vorherrschende Hämaturie ist ein wichtiges Argument für die Nierentuberkulose in der Abgrenzung zur unspezifischen Pyelonephritis.

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Biochemischer Bluttest

Bei Tuberkulose hängen Veränderungen einiger biochemischer Indizes in erster Linie von der Phase des Prozesses, Komplikationen und verschiedenen Begleiterkrankungen ab. Bei Patienten mit inaktiver Tuberkulose der Lunge und anderer Organe sind das Gesamtprotein und die Proteinfraktionen des Blutserums nicht verändert und bestimmen ihren normalen Gehalt.

Bei akuten Krankheitsformen sowie bei der Verschlimmerung und dem Fortschreiten chronischer Formen der Tuberkulose nimmt der Albumin-Globulin-Koeffizient ab.

Von großer Bedeutung für die Beurteilung des Funktionszustands und der organischen Leberschäden bei Tuberkulose und ihren Komplikationen ist die Bestimmung von direktem und Gesamtbilirubin, Aspartat-Aminotransferase (AST) und Alanin-Aminotransferase (ALT) im Blutserum. Dynamische Bestimmung des Aminotransferasespiegels. Bilirubin bei der Behandlung von Patienten mit Tuberkulose, insbesondere bei schweren Formen, ist ein obligatorischer Bestandteil der biochemischen Untersuchung von Patienten mit Tuberkulose und wird monatlich durchgeführt.

Zur Beurteilung des Nierenfunktionszustandes werden Serumkreatinin bestimmt und die glomeruläre Filtrationsrate nach der Cockcroft-Gault-Formel berechnet. Die Berechnung der glomerulären Filtrationsrate nach dem Reberg-Test liefert weniger genaue Ergebnisse.

Das Hauptziel dynamischer biochemischer Untersuchungen an Patienten mit Tuberkulose besteht darin, den Verlauf des Prozesses zu überwachen, Nebenwirkungen von Medikamenten rechtzeitig zu erkennen und auftretende Homöostasestörungen angemessen zu korrigieren.

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Anwendung biochemischer Forschungsmethoden bei extrapulmonaler Tuberkulose

Als aussagekräftigster Indikator gilt der Gehalt an Tuberculostearinsäure in biologischen Flüssigkeiten, seine Bestimmung ist jedoch mit technischen Schwierigkeiten verbunden (Notwendigkeit des Einsatzes von Gaschromatographie und Massenspektrometrie).

Die Messung der Aktivität der Adenosindeaminase – eines Enzyms, das in Synovial-, Perikard-, Aszites- und Cerebrospinalflüssigkeiten vorkommt – ist vielversprechend. Die Hauptproduzenten der Adenosindeaminase sind Lymphozyten und Monozyten. Die Bestimmung der Adenosindeaminase-Aktivität in biologischen Flüssigkeiten erleichtert die Diagnose von tuberkulöser Synovitis, Lymphknotentuberkulose, tuberkulöser Meningitis und tuberkulöser Serositis.

Einige biochemische Indikatoren werden aufgrund ihrer Unspezifität nur in biologischen Flüssigkeiten in der Nähe der Läsion bestimmt. Der Spiegel der Indikatoren wird nach subkutaner oder intradermaler Tuberkulingabe gemessen (üblicherweise vor der Verabreichung sowie 48 und 72 Stunden danach). Anschließend wird der Anstieg des Markerspiegels (in %) im Verhältnis zum Ausgangswert berechnet.

Optimalerweise wird die Aktivität des organspezifischen Enzyms Transamidinase im Urin bestimmt; sein Auftreten wird bei Nierenschäden unterschiedlicher Genese beobachtet. Die Untersuchung der Transamidinase ist nur unter Bedingungen der subkutanen Verabreichung von Tuberkulin gerechtfertigt, um den lokalen Entzündungsprozess zu verschlimmern. Die Transamidinaseaktivität wird initial und 24–72 Stunden nach Gabe von 50 TE Tuberkulin im Urin bestimmt. Eine Erhöhung der Fermenturie um das Zweifache oder mehr ermöglicht in 82 % der Fälle die Unterscheidung zwischen aktiver Nierentuberkulose und einer Verschlimmerung einer chronischen Pyelonephritis.

Bei Tuberkulose der weiblichen Geschlechtsorgane werden die Haptoglobin- und Malondialdehydkonzentrationen im Blut unter den Bedingungen des Tuberkulin-Provokationstests bestimmt. Tuberkulin wird in einer Dosis von 50 TE subkutan verabreicht und nach 72 Stunden wird eine erneute biochemische Untersuchung durchgeführt. Bei tuberkulöser Ätiologie beträgt der Anstieg des Haptoglobinspiegels mindestens 28 % und der Malondialdehydspiegel 39 % oder mehr. Die Aktivität der Adenosindeaminase wird ebenfalls in der aus dem Douglas-Raum gewonnenen Peritonealflüssigkeit bestimmt. Die Punktion wird 72 Stunden nach der intradermalen Verabreichung von Tuberkulin in Dosen von 0,1 TE und 0,01 TE im Bereich der Projektion der inneren Geschlechtsorgane auf die vordere Bauchdecke erneut untersucht. Eine Erhöhung der Aktivität der Adenosindeaminase um 10 % oder mehr gegenüber dem Ausgangswert weist auf einen tuberkulösen Prozess hin.

Bei Augenschäden wird die im Auge auftretende fokale Reaktion als Reaktion auf Antigenstimulation untersucht. In diesem Fall ist die Entwicklung einer stark ausgeprägten Reaktion, begleitet von einer Abnahme der Sehfunktionen, unerwünscht. Da die Beurteilung minimaler fokaler Reaktionen oft schwierig ist, empfiehlt es sich, parallel dazu den Grad des Anstiegs von Haptoglobin oder Adenosindeaminase im Blutserum zu betrachten, um die Schlussfolgerung zu objektivieren.

Alle biochemischen Untersuchungen sollten in Kombination mit anderen Methoden durchgeführt werden.

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Untersuchung des Blutgerinnungssystems

Die Bedeutung der Untersuchung des Zustands des Blutgerinnungssystems in der Phthisiologie liegt im Auftreten von Hämoptysen oder Lungenblutungen bei einer Reihe von Patienten mit Lungentuberkulose sowie in Hämokoagulationskomplikationen bei der chirurgischen Behandlung von Tuberkulose begründet. Darüber hinaus beeinflusst die natürlicherweise auftretende latente intravaskuläre Hämokoagulation den Krankheitsverlauf und die Wirksamkeit der Chemotherapie.

Bei Patienten mit Lungentuberkulose mit vorherrschender exsudativer Entzündungskomponente kommt es zu einer Abnahme der gerinnungshemmenden Aktivität des Blutes. Bei Patienten mit geringer Prävalenz spezifischer Lungenschäden mit vorherrschender produktiver Entzündungskomponente ist die intravaskuläre Hämokoagulation nur geringfügig ausgeprägt. Bei Patienten mit Lungentuberkulose mit Hämoptyse und Lungenblutungen ist der Zustand des Blutgerinnungssystems anders: Bei Patienten mit geringem Blutverlust auf dem Höhepunkt der Hämoptoe oder unmittelbar nach deren Beendigung kommt es aufgrund einer ausgeprägten Intensivierung der Thrombinbildungsprozesse zu einem starken Anstieg der Blutgerinnungsfähigkeit unter Beibehaltung einer erhöhten „strukturellen“ Gerinnungsfähigkeit. Bei Patienten mit massivem Blutverlust kommt es aufgrund einer Abnahme der Fibrinogenkonzentration, der Faktor-XIII-Aktivität und der Thrombozytenzahl zu einer Abnahme des Gerinnungspotentials. Im Stadium der chirurgischen Behandlung treten bei Patienten mit begrenzten Formen der Lungentuberkulose keine signifikanten Störungen des Homöostasesystems auf. Bei Patienten mit ausgedehnten Prozessen entwickelt sich bei der Durchführung einer Pneumonektomie oder Pleuropneumonektomie häufig ein DIC-Syndrom, das die Form einer „Zweiterkrankung“ annehmen kann.

Um den Zustand des Blutgerinnungssystems bei Patienten mit Lungentuberkulose zu überwachen, ist die Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT), des Fibrinogens, der Thrombinzeit, des Prothrombinindex sowie der Blutungszeit und der Blutgerinnungszeit erforderlich.

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Hormonelle Studien

Moderne experimentelle und klinische Beobachtungen weisen auf Veränderungen des Hormonstatus bei spezifischen tuberkulösen Lungenentzündungen hin. Es ist erwiesen, dass die Korrektur von Funktionsstörungen des Hypophysen-Nebennieren-, Hypophysen-Schilddrüsen-Systems und der Pankreasfunktion in Kombination mit einer Tuberkulosetherapie zur Aktivierung der Fibrogenese und zu Reparaturprozessen im Fokus spezifischer Entzündungen beiträgt.

Der Funktionszustand des Hypophysen-Schilddrüsen-Systems wird anhand des Gehalts an Trijodthyronin (T3), Thyroxin (T4) und Hypophysen-Schilddrüsen-stimulierendem Hormon (TSH) im Blutserum beurteilt _. Es _wurde festgestellt, dass bei 38-45 % der Patienten mit Lungentuberkulose eine subklinische Hypothyreose festgestellt wird. Am häufigsten wird sie bei disseminierten und fibrokavernösen Formen des Prozesses diagnostiziert. Bei diesen Formen sind die Spiegel von T3 und T4 am stärksten erniedrigt _, und es kommt zu _einem Ungleichgewicht dieser Hormone in Form eines Anstiegs des T4 _/ T3 _{-Verhältnisses}.

Die Funktion der Nebennierenrinde wird anhand des Serumcortisolspiegels und die endokrine Funktion der Bauchspeicheldrüse anhand der Konzentration des immunreaktiven Insulins beurteilt. In der akuten Phase einer Infektionskrankheit steigt der Bedarf an endogenem Cortisol und Insulin. Hyperinsulinämie weist auch auf eine Insulinresistenz des Körpergewebes hin, die typisch für jeden aktiven Entzündungsprozess, insbesondere einen spezifischen, ist. Die Bestimmung der Glukokortikoidfunktion der Nebennieren bei aktiver Lungentuberkulose ermöglicht es uns, bei den meisten Patienten das Vorhandensein von Hyperkortizismus festzustellen. Normale Cortisolkonzentrationen im Blut eines Patienten mit infektiöser Entzündung in der akuten Phase sollten als relative Insuffizienz der Glukokortikoidfunktion der Nebennierenrinde angesehen werden, die als Grundlage für eine Ersatztherapie mit ausreichenden Dosen von Glukokortikoiden dienen kann.

Fast ein Drittel der Patienten mit Lungentuberkulose weist einen niedrigen Insulinämiespiegel auf, der sich der unteren Normgrenze nähert, während 13–20 % einen signifikanten Hyperinsulinismus aufweisen. Sowohl relativer Hypo- als auch Hyperinsulinismus sind hohe Risikofaktoren für die Entwicklung von Kohlenhydratstoffwechselstörungen unterschiedlichen Schweregrades. Diese Veränderungen der funktionellen Aktivität der Pankreas-B-Zellen erfordern eine regelmäßige Glykämieüberwachung bei Patienten mit Tuberkulose und eine rechtzeitige Prävention von Diabetes mellitus. Dies dient zudem als zusätzliche Begründung für die Angemessenheit des Einsatzes physiologischer Insulindosen in der komplexen Therapie der Tuberkulose.

Im Allgemeinen sind der Abfall des Schilddrüsenhormonspiegels, dessen Ungleichgewicht, Hypercortisolämie und Hyperinsulinismus bei Patienten mit einem schweren Verlauf der Tuberkulose, mit ausgedehnten Lungenläsionen und ausgeprägten Symptomen einer Tuberkuloseintoxikation am ausgeprägtesten.

Mikrobiologische Diagnostik der Tuberkulose

Mikrobiologische Untersuchungen sind notwendig, um Tuberkulosepatienten zu identifizieren, die Diagnose zu bestätigen, die Chemotherapie zu überwachen und zu korrigieren und den Behandlungserfolg zu beurteilen – also von der Registrierung eines Tuberkulosepatienten bis zu seiner Löschung aus dem Register.

Alle epidemiologischen Programme und Projekte basieren auf der Ermittlung der Anzahl der Bakterienausscheider, was ohne den Einsatz von Labormethoden zum Nachweis von Tuberkulose-Mykobakterien nicht möglich ist. Bei der Untersuchung der sogenannten desorganisierten Bevölkerung erreicht der Anteil der Bakterienausscheider 70 % oder mehr, was Labormethoden zu einem recht effektiven Mittel zur Identifizierung von Tuberkulosepatienten in dieser Bevölkerungsgruppe macht.

Traditionelle mikrobiologische Methoden zur Tuberkulosediagnostik sind bakterioskopische und kulturelle Untersuchungen. Moderne Methoden umfassen die Kultivierung von Tuberkulose-Mykobakterien in automatisierten Systemen und die PCR. Alle diese Methoden müssen jedoch zwangsläufig mit klassischen bakteriologischen Methoden kombiniert werden.

Sammlung von Diagnosematerial

Die Wirksamkeit von Laboruntersuchungen hängt maßgeblich von der Qualität des Diagnosematerials ab. Die Einhaltung der Regeln für die Sammlung, Lagerung und den Transport von Diagnosematerial sowie die präzise Umsetzung des Patientenuntersuchungsalgorithmus wirken sich direkt auf das Ergebnis aus und gewährleisten die biologische Sicherheit.

Für den Tuberkulosetest werden verschiedene Materialien verwendet. Da die Lungentuberkulose die häufigste Form der Tuberkuloseinfektion ist, kommen als Testmaterial hauptsächlich Sputum und andere Ausflüsse aus dem Tracheobronchialbaum infrage: Ausfluss aus den oberen Atemwegen nach Aerosol-Inhalation, Bronchiallavagewasser, bronchoalveoläre Lavagen, Material aus Bronchoskopie, transtrachealer und intrapulmonaler Biopsie: Bronchialaspirat, Kehlkopfausstriche, Exsudate, Wundausstriche usw.

Die Effektivität der Forschung erhöht sich, wenn eine kontrollierte Materialentnahme beim Patienten durchgeführt wird. Zu diesem Zweck wird ein speziell ausgestatteter Raum bereitgestellt oder es werden spezielle Kabinen angeschafft. Die Materialentnahme ist ein gefährlicher Vorgang, daher muss Forschungsmaterial unter Einhaltung der Infektionsschutzvorschriften gesammelt werden.

Material zum Testen auf Mycobacterium tuberculosis wird in sterilen Fläschchen mit fest verschraubten Verschlüssen gesammelt, um eine Kontamination der Umgebung zu verhindern und das gesammelte Material vor Kontamination zu schützen.

Fläschchen zum Sammeln von Diagnosematerial müssen die folgenden Anforderungen erfüllen:

• muss aus schlagfestem Material bestehen;
• sollte beim Autoklavieren leicht schmelzen;
• ausreichend Volumen (40-50 ml) haben:
• eine weite Öffnung zum Auffangen des Auswurfs haben (Durchmesser mindestens 30 mm);
• Sie müssen leicht zu handhaben und transparent oder durchscheinend sein, sodass die Menge und Qualität der gesammelten Probe beurteilt werden kann, ohne den Deckel zu öffnen.

Um optimale Forschungsergebnisse zu erzielen, müssen folgende Voraussetzungen erfüllt sein:

• Die Materialsammlung sollte vor Beginn der Chemotherapie erfolgen.
• das Material für die Studie muss morgens vor dem Essen oder der Einnahme von Medikamenten gesammelt werden;
• Für die Studie ist es ratsam, mindestens 3 morgendliche Sputumproben zu sammeln. Der Sputum wird an 3 aufeinanderfolgenden Tagen gesammelt;
• Das gesammelte Material muss so schnell wie möglich an das Labor geliefert werden:
• in Fällen, in denen es nicht möglich ist, das Material sofort an das Labor zu liefern, wird es höchstens 48 Stunden lang in einem Kühlschrank bei einer Lufttemperatur von 4 °C gelagert;
• Beim Transport des Materials muss besonders auf die Unversehrtheit der Flaschen geachtet werden.

Richtig gesammelter Auswurf hat einen schleimigen oder schleimig-eitrigen Charakter. Das optimale Volumen der untersuchten Auswurfmenge beträgt 3-5 ml.

Die Entnahme des Sputums erfolgt unter Aufsicht eines medizinischen Fachpersonals. Die für die Entnahme des Sputums verantwortlichen Personen müssen die Einhaltung bestimmter Regeln sicherstellen:

• Es ist notwendig, dem Patienten den Zweck der Untersuchung und die Notwendigkeit zu erklären, nicht Speichel oder Nasen-Rachen-Schleim abzuhusten, sondern den Inhalt der tiefen Abschnitte der Atemwege. Dies kann durch einen produktiven Husten erreicht werden, der nach mehreren (2-3) tiefen Atemzügen auftritt. Es ist auch notwendig, den Patienten darauf hinzuweisen, dass er zuerst seinen Mund mit kochendem Wasser ausspülen muss, um den Hauptteil der in der Mundhöhle vegetierenden Mikroflora und Speisereste zu entfernen, die die Untersuchung des Auswurfs erschweren.
• Das medizinische Personal, das mit der Entnahme von Sputum befasst ist, muss neben Kittel und Haube eine Maske, Gummihandschuhe und eine Gummischürze tragen;
• Wenn er hinter dem Patienten steht, wird ihm geraten, die Flasche so nah wie möglich an die Lippen zu halten und den Auswurf beim Abhusten sofort hineinzutrennen, wobei darauf zu achten ist, dass der Luftstrom vom medizinischen Personal weg gerichtet ist:
• Sobald die Sputumentnahme abgeschlossen ist, sollte das medizinische Fachpersonal die Flasche sorgfältig mit dem Deckel verschließen und die Menge und Qualität des gesammelten Sputums beurteilen. Anschließend wird die Flasche beschriftet und für den Transport ins Labor in eine spezielle Box gelegt.

Wenn der Patient keinen Auswurf produziert, sollte ihm am Vorabend und am frühen Morgen des Entnahmetages ein Expektorans verabreicht werden: Eibischwurzelextrakt (Mucaltin), Bromhexin, Ambroxol usw. – oder es sollte eine reizende Inhalation mit im Raum installierten Geräten zur Sputumsammlung durchgeführt werden. Das so gesammelte Material unterliegt keiner Konservierung und sollte am Entnahmetag untersucht werden. Um eine „Ablehnung“ im Labor zu vermeiden, sollte in der Überweisung ein besonderer Vermerk gemacht werden.

Werden mikrobiologische Untersuchungen nicht in einer Einrichtung durchgeführt, muss das gesammelte diagnostische Material zentral an das Labor geliefert werden. Dabei ist zu beachten, dass es zwischen den Lieferungen gekühlt oder konserviert aufbewahrt wird. Die Lieferung erfolgt in leicht desinfizierbaren Transportboxen. Jede Probe muss mit einem entsprechenden Etikett versehen sein, und der gesamten Charge muss ein ausgefülltes Begleitformular beiliegen.

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Arten und Häufigkeit der Untersuchung von Patienten

Bei der ersten, sogenannten diagnostischen Untersuchung eines Patienten auf Tuberkulose ist es notwendig, mindestens 3 Portionen Sputum zu untersuchen, die im Laufe von 2 bis 3 Tagen unter Aufsicht von medizinischem Personal gesammelt wurden, was die Effektivität der Mikroskopie erhöht.

Das primäre Tuberkulosescreening sollte von allen medizinischen und diagnostischen Einrichtungen des Gesundheitssystems durchgeführt werden. Um die Effektivität der Primäruntersuchung zu erhöhen, wurden kürzlich sogenannte Mikroskopiezentren auf Basis klinisch-diagnostischer Labore eingerichtet, die mit modernen Mikroskopen und Geräten zur Gewährleistung der Seuchensicherheit ausgestattet sind.

Anti-Tuberkulose-Institutionen verwenden ein Untersuchungsschema, das mindestens drei Mal innerhalb von drei Tagen eine Untersuchung von Sputum oder anderem diagnostischen Material vorsieht. Während der Behandlung werden in der intensiven Chemotherapiephase regelmäßig mindestens einmal im Monat mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt. Beim Übergang in die Nachsorgephase werden die Untersuchungen seltener durchgeführt - im Abstand von 2-3 Monaten, wobei die Häufigkeit der Untersuchungen auf zwei reduziert wird.

Merkmale der Sammlung von Diagnosematerial für extrapulmonale Tuberkulose

Ein Merkmal des pathologischen Materials bei extrapulmonalen Formen der Tuberkulose ist die geringe Konzentration von Mycobacterium tuberculosis, die empfindlichere Methoden der mikrobiologischen Forschung erfordert, vor allem Methoden der Aussaat auf einem Nährmedium.

Bei einer urogenitalen Tuberkulose ist Urin das am leichtesten zugängliche Untersuchungsmaterial. Die Urinentnahme sollte von einer speziell ausgebildeten Krankenschwester durchgeführt werden.

Die äußeren Genitalien werden mit Wasser und Seife oder einer schwachen Kaliumpermanganatlösung gewaschen. Die äußere Öffnung der Harnröhre wird sorgfältig behandelt. Der mittlere Teil des Morgenurins wird in einer sterilen Flasche gesammelt: bei Männern – natürlich, bei Frauen – mit einem Katheter. Urin aus dem Nierenbecken wird während der Katheterisierung einer oder zweier Nieren in sterilen Reagenzgläsern gesammelt, im letzteren Fall – notwendigerweise getrennt von jeder Niere. Eine kleine Menge dieses Urins wird zentrifugiert, das Sediment wird untersucht.

Bei Männern werden Spermien, Hodenpunktionen und Prostatasekrete zentrifugiert, um ein Sediment zu erhalten. Bei jeder Lokalisation eines bestimmten Prozesses im Genitalbereich des Mannes kann eine Prostatamassage die Freisetzung von Sekreten fördern, die Tuberkulose-Mykobakterien enthalten.

Menstruationsblut wird von Frauen durch Absaugen oder mithilfe einer Kafka-Kappe gewonnen. Das gewonnene Material wird durch Waschen mit destilliertem Wasser und anschließendes Zentrifugieren von Erythrozyten befreit. Das Sediment wird untersucht.

Der Ausfluss aus dem Gebärmutterhalskanal wird in einem Behälter oder einer Kafka-Kappe gesammelt, d. h. es ist wünschenswert, 1–2 ml pathologisches Material anzusammeln.

Material, das bei chirurgischen Eingriffen an Nieren, Genitalien, Biopsien und Endometriumabschabungen gewonnen wurde, wird homogenisiert. Dazu wird es in einen sterilen Mörser gegeben und mit einer sterilen Schere gründlich zerkleinert. Der entstandenen Suspension wird steriler Flusssand in einer Menge zugesetzt, die ihrer Masse entspricht. Anschließend werden 0,5–1,0 ml isotonische Natriumchloridlösung hinzugefügt und alles unter Zugabe von 4–5 ml isotonischer Natriumchloridlösung gemahlen, bis eine breiige Masse entsteht. Anschließend lässt man die Masse 1–1,5 Minuten absetzen und untersucht den Überstand.

Tuberkulose der Knochen und Gelenke. Der mit einer sterilen Spritze entnommene Eiter (Abszess) wird in einen sterilen Behälter gegeben und sofort ins Labor geliefert. Mit einer sterilen Pipette, die zuvor mit steriler isotonischer Natriumchloridlösung angefeuchtet wurde, werden 2–5 ml Eiter entnommen, in eine Flasche mit Perlen gegeben und weitere 2–3 ml isotonische Natriumchloridlösung hinzugefügt. Die Flasche wird mit einem Stopfen verschlossen und 8–10 Minuten im Schüttler geschüttelt. Die homogenisierte Suspension wird untersucht.

Bei fistelartigen Formen der osteoartikulären Tuberkulose wird Eiter aus der Fistel entnommen. Reichlicher Ausfluss wird direkt in ein Reagenzglas gesammelt. Bei geringem Eiterausfluss wird der Fistelgang mit einer sterilen isotonischen Natriumchloridlösung gespült und die in einem Reagenzglas oder einem eitergetränkten Tampon gesammelten Spülflüssigkeiten zur Untersuchung geschickt.

Bei chirurgischen Eingriffen an Knochen und Gelenken gewonnenes Operationsmaterial kann aus eitrig-nekrotischen Massen, Granulationen, Narbengewebe, Knochengewebe, Synovialmembrangewebe und anderen Substraten bestehen. Die Verarbeitung erfolgt wie bei Nierentuberkulose.

Unmittelbar nach der Punktion erfolgt eine mikrobiologische Untersuchung der Synovialflüssigkeit in einer 3%igen Natriumcitratlösung (im Verhältnis 1:1) zur Verhinderung einer Gerinnung.

Tuberkulose der Lymphknoten. Eiter, der bei der Punktion der Lymphknoten gewonnen wird, wird wie Eiter aus Abszessen untersucht. Lymphknotengewebe, das bei chirurgischen Eingriffen und Biopsien gewonnen wird, wird wie bei anderen Formen der Tuberkulose untersucht.

Die Untersuchung von Fäkalien auf Mycobacterium tuberculosis wird äußerst selten durchgeführt, da positive Ergebnisse fast vollständig ausbleiben.

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Mikroskopie von Mykobakterien

Die Sputummikroskopie ist eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Methode, die bei Verdacht auf Tuberkulose immer angewendet werden sollte. Darüber hinaus wird diese Untersuchung durchgeführt, um die Wirksamkeit der Chemotherapie zu beurteilen und bei fehlenden Kulturergebnissen eine Genesung oder ein Therapieversagen zu bestätigen.

Zur mikroskopischen Untersuchung kommen zwei Methoden zum Einsatz:

• direkte Mikroskopiemethode, bei der ein Abstrich direkt aus dem Diagnosematerial erstellt wird;
• eine Methode zur Mikroskopie von Sedimenten, die aus mit Dekontaminationsmitteln behandeltem Material für die Kulturforschung hergestellt wurden.

Die erste Methode wird in Laboren verwendet, in denen nur mikroskopische Untersuchungen durchgeführt werden (klinisch-diagnostische Labore des allgemeinen medizinischen Netzwerks).

Die besten Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung werden durch Konzentrierung des Untersuchungsmaterials (beispielsweise durch Zentrifugation) erzielt.

Um Mycobacterium tuberculosis mit einer 50%igen Wahrscheinlichkeit mikroskopisch nachweisen zu können, muss 1 ml Sputum mehr als 5.000 mikrobielle Zellen enthalten. Sputum von Patienten mit pulmonalen Formen der Tuberkulose enthält in der Regel eine signifikante Anzahl säurefester Bakterien, wodurch diese bakterioskopisch zuverlässig nachgewiesen werden können. Die diagnostische Sensitivität dieser Methode kann durch die Untersuchung mehrerer Sputumproben eines Patienten erhöht werden. Ein negatives bakterioskopisches Untersuchungsergebnis schließt die Diagnose Tuberkulose nicht aus, da das Sputum mancher Patienten weniger Mycobacterium enthält, als mikroskopisch nachweisbar ist. Auch eine mangelhafte Vorbereitung des Sputumausstrichs kann ein negatives bakterioskopisches Untersuchungsergebnis verursachen.

Die gängigste Methode zum Nachweis säurefester Mykobakterien in einem Ausstrich ist die Ziehl-Neelsen-Färbung. Die Methode basiert auf dem Eindringen von Karbolfuchsin in eine mikrobielle Zelle durch eine Membran, die eine Wachs-Lipid-Schicht enthält, unter gleichzeitiger Erhitzung und der starken Ätzwirkung von Phenol. Die anschließende Entfärbung des Ausstrichs mit einer 25%igen Schwefelsäurelösung oder 3%igem Salzalkohol führt zur Entfärbung aller nicht säurefesten Strukturen. Die entfärbten Elemente des Ausstrichs werden mit einer 0,3%igen Methylenblaulösung angefärbt. Mykobakterien nehmen herkömmliche Anilinfarbstoffe nicht wahr, wodurch säurefeste Mykobakterien himbeerrot und andere Mikroben und Zellelemente blau gefärbt werden.

Zur Untersuchung von nach Ziehl-Neelsen gefärbten Ausstrichen wird ein Lichtbinokularmikroskop mit Immersionsobjektiv (90- oder 100-fache Vergrößerung) und einem Okular mit 7- oder 10-facher Vergrößerung verwendet. 100 Sichtfelder werden untersucht, was ausreicht, um einzelne Mykobakterien im Ausstrich nachzuweisen. Bei negativem Ergebnis empfiehlt sich die Untersuchung weiterer 200 Sichtfelder zur Bestätigung. Die Ergebnisse werden dokumentiert und geben die Anzahl der nachgewiesenen säurefesten Mykobakterien (AFB) an.

Zusätzlich zu dieser Methode wird für die Lumineszenzmikroskopie die Fluorochromfärbung verwendet, mit der die besten Ergebnisse erzielt werden können. Der Einsatz dieser Methode erhöht die Effizienz der Mikroskopie um 10–15 %. Wenn Mykobakterien mit Lumineszenzfarbstoffen (Auramin, Rhodamin usw.) behandelt werden, binden diese Substanzen auch an die wachsartigen Strukturen der mikrobiellen Zelle. Wenn gefärbte Zellen mit einer anregenden Lichtquelle (einem bestimmten Spektrum ultravioletter Strahlung) bestrahlt werden, beginnen sie vor einem schwarzen oder dunkelgrünen Hintergrund orange oder leuchtend rot zu leuchten. Aufgrund der hohen Helligkeit und des Kontrasts des sichtbaren Bildes kann die Gesamtvergrößerung des Mikroskops um das 4- bis 10-fache reduziert werden, was das Sichtfeld erweitert und die Betrachtungszeit des Präparats verkürzt. Gleichzeitig kann aufgrund der deutlich größeren Schärfentiefe der Untersuchungskomfort erhöht werden.

Mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie ist die Betrachtung desselben Ausstrichbereichs deutlich schneller als mit der Lichtmikroskopie von Ziehl-Neelsen-gefärbten Ausstrichen. Betrachtet ein Mikroskopiker an einem Arbeitstag etwa 20–25 solcher Ausstriche, kann er mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie gleichzeitig über 60–80 Proben untersuchen. Erfahrene Mikroskopiker wissen, dass die Zellfärbung mit einer Mischung aus Auramin und Rhodamin spezifisch für säurefeste Mykobakterien ist, die in diesem Fall wie Goldstäbchen aussehen. Saprophyten sind grünlich gefärbt.

Ein weiterer wichtiger Vorteil der Fluoreszenzmikroskopie ist die Möglichkeit, veränderte Mykobakterien zu erkennen, die unter dem Einfluss einer Reihe ungünstiger Faktoren, insbesondere einer intensiven Chemotherapie, ihre säureresistenten Eigenschaften verloren haben und daher durch die Ziehl-Neelsen-Färbung nicht erkannt werden.

Zu den Nachteilen der Fluoreszenzmikroskopie zählen die relativ hohen Kosten für Mikroskop und Betrieb. In zentralisierten oder anderen großen Laboren, in denen der Arbeitsaufwand die Norm von drei Laboranten mit drei konventionellen Mikroskopen übersteigt, ist es jedoch günstiger, stattdessen ein Fluoreszenzmikroskop zu verwenden.

Bakterioskopische Methoden haben eine ziemlich hohe Spezifität (89-100%). Etwa 97 % der mit einer mikroskopischen Methode erzielten positiven Ergebnisse werden durch die Ergebnisse der Aussaat eindeutig bestätigt.

Es ist zu beachten, dass die mikroskopische Untersuchung eines Abstrichs von pathologischem Material keine Bestimmung der Art der nachgewiesenen säureresistenten Mykobakterien ermöglicht. Die mikroskopische Methode lässt lediglich Rückschlüsse auf das Vorhandensein oder Fehlen säureresistenter Mikroorganismen im Präparat zu, was durch die natürliche Existenz einer großen Anzahl nichttuberkulöser säureresistenter Mikroorganismen erklärt wird, die morphologisch den Mykobakterien des Tuberkulosekomplexes ähnlich sind.

Die Auswertung der Mikroskopieergebnisse erfolgt in semiquantitativen Einheiten.

Um die Ergebnisse verschiedener Mikroskopiemethoden vergleichen zu können, werden empirische Koeffizienten eingeführt. Um beispielsweise die Ergebnisse eines mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbten Ausstrichs mit den Daten einer Lichtmikroskopiestudie (1000-fache Vergrößerung) zu vergleichen, ist es notwendig, die Anzahl der mit einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesenen säurefesten Mykobakterien durch den entsprechenden Koeffizienten zu dividieren: bei 250-facher Vergrößerung des Mikroskops – durch 10, bei 450-facher Vergrößerung – durch 4, bei 630-facher Vergrößerung – durch 2.

Merkmale der Mikroskopie bei extrapulmonaler Tuberkulose

Es wird sowohl direkte Mikroskopie als auch Mikroskopie von Ausstrichen nach Anreicherung mit anschließender Ziehl-Neelsen-Färbung oder Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Die direkte Mikroskopie von Ausstrichen ist aufgrund der geringen Mykobakterienkonzentration im Material unwirksam, daher ist der Einsatz von Anreicherungsmethoden sinnvoller. Am effektivsten ist die Zentrifugation. Bei viskosem biologischem Material wird eine Zentrifugation mit gleichzeitiger Homogenisierung und Verflüssigung des Materials eingesetzt. Dies erfolgt mit Hochgeschwindigkeitszentrifugen mit einer Zentrifugalkraft von 3000 g und Hypochloritlösungen. Andere Anreicherungsmethoden, wie beispielsweise die Mikroflotation, werden derzeit aufgrund der Bildung biologisch gefährlicher Aerosole nicht eingesetzt.

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Kulturmethode zur Diagnose von Tuberkulose

Die Anzuchtmethode bzw. Kulturmethode ist sensitiver als die Ausstrichmikroskopie und bietet gegenüber dieser eine Reihe von Vorteilen. Sie ermöglicht den Nachweis mehrerer Dutzend lebensfähiger Mykobakterien im Untersuchungsmaterial und hat einen hohen diagnostischen Wert. Dies ist insbesondere bei der Untersuchung von Material neu diagnostizierter oder behandelter Patienten wichtig, die eine geringe Anzahl von Mykobakterien ausscheiden.

Im Vergleich zur Mikroskopie ermöglicht die Kulturforschung eine Erhöhung der Anzahl erkannter Tuberkulosepatienten um mehr als 15–25 % sowie den Nachweis von Tuberkulose in früheren Stadien, wenn die Krankheit noch gut behandelbar ist. Ein sehr wichtiger Vorteil der Kulturforschung ist die Möglichkeit, eine Erregerkultur zu erhalten, die hinsichtlich Arzneimittelempfindlichkeit, Virulenz und anderen biologischen Eigenschaften identifiziert und untersucht werden kann.

Zu den Nachteilen der Kultivierungsmethoden zählen ihre Dauer (die Wartezeit für Materialien beträgt bis zu 10 Wochen), die höheren Kosten und die Komplexität der Verarbeitung des diagnostischen Materials.

Grundsätze der Vorsaatbehandlung von Diagnosematerial

Konventionelle mikrobiologische Methoden eignen sich nicht für Tuberkulose-Tests. Dies liegt daran, dass Tuberkulose-Mykobakterien sehr langsam wachsen und die meisten klinischen Proben schnell wachsende pyogene und fäulniserregende Mikroorganismen und Pilze enthalten. Ihr schnelles Wachstum auf reichhaltigen Nährmedien beeinträchtigt die Entwicklung der Mykobakterien und verhindert die Isolierung des Tuberkulose-Erregers. Daher muss das diagnostische Material vor der Aussaat vorbehandelt werden. Zudem sind die aus den Atemwegen des Patienten freigesetzten Mykobakterien meist von einer großen Schleimmenge umgeben, was ihre Konzentration erschwert. Daher müssen Sputum und ähnliche Materialien vor der Aussaat verflüssigt und dekontaminiert werden.

Alle Reinigungs- und Desinfektionsmittel haben eine mehr oder weniger ausgeprägte toxische Wirkung auf Mykobakterien. Durch die Behandlung können bis zu 90 % der Mykobakterien absterben. Um einen ausreichenden Anteil der Mykobakterienpopulation zu erhalten, sind schonende Behandlungsmethoden erforderlich, die einerseits die Unterdrückung schnell wachsender pyogener und fäulniserregender Mikroorganismen und andererseits die maximale Erhaltung der Lebensfähigkeit der im Material vorhandenen Mykobakterien ermöglichen.

Je nach Material, Homogenität und Kontaminationsgrad werden zur Vorbehandlung unterschiedliche Dekontaminationsmittel verwendet: für Sputum – 4 % Natriumhydroxidlösung, 10 % Trinatriumphosphatlösungen, Benzalkoniumchlorid-Trinatriumphosphat, NALC-NaOH (N-Acetyl-L-Cystein-Natriumhydroxid) mit einer NaOH-Endkonzentration von 1 %, für Urin und andere flüssige Materialien – 3 % Schwefelsäurelösung, für kontaminierte Proben, fetthaltige Materialien – Oxalsäurelösung bis zu 5 %. Zusätzlich werden in einigen Fällen Enzyme und Tenside (Detergenzien) verwendet. Die Verwendung von Tween und einigen anderen Detergenzien geht mit einem geringeren Absterben mykobakterieller Zellen einher (40 – 50 % überleben). Sie können jedoch nur für flüssige Materialien verwendet werden. NALC-NaOH, das in Kits hergestellt wird, wird weltweit am häufigsten verwendet. Mit dieser Methode können über 85 % der mykobakteriellen Zellpopulation isoliert werden. Die Dekontamination gewebehaltiger Feststoffe ist schwieriger, da der Dispersionsgrad des Materials während der Homogenisierung schwer abzuschätzen ist. Beispielsweise geht die Verarbeitung von Lymphknotenbiopsien häufig mit einer erhöhten Kontaminationshäufigkeit mit Fremdflora einher. In diesem Fall kann 1%iges Etonium verwendet werden.

Inhomogenes Material wird mit Hilfe von Glasperlen unter Zugabe von Dekontaminationsmitteln homogenisiert. Flüssige Materialien werden vorzentrifugiert und nur das Sediment wird verarbeitet.

Technik der Aussaat und Inkubation

Nach der Vorbehandlung wird das Material zentrifugiert, wodurch die Mykobakterien ausgefällt und ihr Gehalt im Sediment erhöht wird („Sedimentanreicherung“). Das entstandene Sediment wird neutralisiert und auf die Oberfläche dichter Nährmedien oder Reagenzgläser mit flüssigem (halbflüssigem) Medium ausgesät. Aus dem verbleibenden Sediment werden Ausstriche für die mikroskopische Untersuchung hergestellt. Die Aussaattechnik muss eine Kreuzkontamination des diagnostischen Materials verhindern.

Für eine zuverlässige klinische Interpretation der Ergebnisse mikrobiologischer Untersuchungen muss folgende Regel beachtet werden: Mikroskopische und kulturelle Untersuchungen müssen parallel aus derselben Probe des diagnostischen Materials durchgeführt werden.

Die beimpften Röhrchen werden zwei Tage lang horizontal in einen Thermostaten bei 37 ^° C gestellt. Dies gewährleistet eine gleichmäßigere Aufnahme des Materials in das Nährmedium. Nach zwei Tagen werden die Röhrchen in eine vertikale Position gebracht und mit Gummi- oder Silikonstopfen hermetisch verschlossen, um ein Austrocknen des beimpften Mediums zu verhindern.

Die Pflanzen werden 10–12 Wochen lang in einem Thermostat bei 37 ^° C gehalten und wöchentlich kontrolliert. Bei jeder Kontrolle werden folgende Parameter erfasst:

• Zeitraum des optisch erkennbaren Wachstums ab dem Tag der Aussaat;
• Wachstumsrate (Anzahl der KBE);
• Kontamination der Kultur mit fremder mikrobieller Flora oder Pilzen (solche Reagenzgläser werden entfernt);
• kein sichtbares Wachstum. Die Röhrchen verbleiben bis zur nächsten Inspektion im Thermostat.

Nährmedien

Zur Kultivierung von Mykobakterien werden verschiedene Nährmedien verwendet: feste, halbflüssige und flüssige. Keines der bekannten Nährmedien verfügt jedoch über Eigenschaften, die das Wachstum aller mykobakteriellen Zellen gewährleisten. Um die Effizienz zu verbessern, wird daher empfohlen, zwei bis drei Nährmedien unterschiedlicher Zusammensetzung gleichzeitig zu verwenden.

Als Standardmedium für die Primärisolierung des Tuberkulose-Erregers und die Bestimmung seiner Arzneimittelempfindlichkeit empfiehlt die WHO das Lowenstein-Jensen-Medium. Dabei handelt es sich um ein dichtes Eimedium, auf dem am 20.–25. Tag nach der Aussaat bakterioskopisch positiven Materials Mykobakterienwachstum erzielt wird. Die Aussaat bakterioskopisch negativen Materials erfordert eine längere Inkubationszeit (bis zu 10–12 Wochen).

In unserem Land hat sich das von E.R. Finn vorgeschlagene Finn-II-Eimedium weit verbreitet. Es unterscheidet sich dadurch, dass es anstelle von L-Asparagin Natriumglutamat verwendet, das andere Wege für die Aminosäuresynthese in Mykobakterien auslöst. Das Wachstum tritt auf diesem Medium etwas früher ein, und die Häufigkeit der Mykobakterienisolierung ist 6–8 % höher als auf dem Lowenstein-Jensen-Medium.

Um die Effizienz der bakteriologischen Diagnostik der extrapulmonalen Tuberkulose zu steigern, empfiehlt es sich, modifizierte Finn-II-Medien in den Nährmedienkomplex aufzunehmen. Zur Wachstumsbeschleunigung wird dem Finn-II-Nährmedium zusätzlich 0,05 % Natriumthioglykolat zugesetzt, wodurch die Sauerstoffkonzentration reduziert wird. Um die Enzymsysteme der Mykobakterien vor toxischen Produkten der Lipidperoxidation zu schützen, wird dem Finn-II-Nährmedium das Antioxidans α-Tocopherolacetat in einer Konzentration von 0,001 μg/ml zugesetzt. Das diagnostische Material wird nach der Standardmethode ausgesät.

In Anti-Tuberkulose-Labors in Russland werden auch andere Modifikationen dichter Nährmedien verwendet: das von GG Mordovsky vorgeschlagene Nährmedium „Novaya“, die von VA Anikin entwickelten Nährmedien A-6 und A-9 usw.

Aufgrund der Tatsache, dass während der Chemotherapie Schäden an verschiedenen Stoffwechselsystemen der mikrobiellen Zelle auftreten, verliert ein Teil der Mykobakterienpopulation die Fähigkeit, sich auf herkömmlichen Nährmedien normal zu entwickeln und benötigt osmotisch ausgeglichene (halbflüssige oder flüssige) Nährmedien.

Auswertung und Erfassung der Ergebnisse der materialkulturdiagnostischen

Einige Stämme und Arten von Mykobakterien wachsen langsam; bereits am 90. Tag kann Wachstum auftreten. Die Anzahl solcher Kulturen ist gering, was jedoch dazu führt, dass die Aussaaten 2,5 bis 3 Monate lang in einem Thermostat aufbewahrt werden müssen.

Virulente Kulturen von Mycobacterium tuberculosis wachsen üblicherweise auf festem Eimedium als R-förmige Kolonien unterschiedlicher Größe und Erscheinung. Die Kolonien sind trocken, runzelig, elfenbeinfarben und leicht pigmentiert. Auf anderen Medien können Mycobacterium tuberculosis-Kolonien feuchter sein. Nach einer Chemotherapie oder während der Behandlung können glatte Kolonien mit feuchtem Wachstum (S-Formen) isoliert werden.

Bei der Isolierung von Kulturen wird eine Reihe spezieller Studien verwendet, um tuberkulöse Mykobakterien von nichttuberkulösen Mykobakterien und säurefesten Saprophyten zu unterscheiden.

Eine positive Antwort wird nach einer obligatorischen mikroskopischen Untersuchung eines Ausstrichs der gewachsenen Kolonien gegeben, die nach Ziehl-Neelsen gefärbt wurden. Bei Mykobakterienwachstum finden sich in den Ausstrichen leuchtend rote Stäbchen, die einzeln oder in Gruppen liegen und Cluster in Form von Filz oder Zöpfen bilden. In jungen Kulturen, insbesondere solchen, die von Patienten isoliert wurden, die lange Zeit mit Chemotherapie behandelt wurden, zeichnen sich Mykobakterien durch einen ausgeprägten Polymorphismus aus, bis hin zum Vorhandensein kurzer, fast kokkoider oder länglicher Varianten, die Pilzmyzel ähneln, sowie stäbchenförmiger Formen.

Die Intensität des mykobakteriellen Wachstums wird nach folgendem Schema angegeben: (+) – 1–20 KBE im Reagenzglas (geringe Bakterienausscheidung); (++) – 20–100 KBE im Reagenzglas (mäßige Bakterienausscheidung); (+++) – > 100 KBE im Reagenzglas (reiche Bakterienausscheidung). In der Labordiagnostik von Tuberkulose reicht es nicht aus, eine Antwort darauf zu geben, ob mit einer bestimmten Methode Mykobakterien nachgewiesen wurden oder nicht. Es ist auch notwendig, eine detaillierte Vorstellung von Umfang und Art der mykobakteriellen Population, ihrer Zusammensetzung und Eigenschaften zu haben. Diese Daten ermöglichen eine korrekte Interpretation des Prozesszustands, die Planung von Taktiken und eine rechtzeitige Anpassung der Behandlung.

In den letzten Jahren wurden agarbasierte Nährmedien mit verschiedenen Wachstumszusätzen und die Verwendung eines speziellen Gasgemisches zur Beschleunigung des Mykobakterienwachstums vorgeschlagen. Um das Wachstum von Mykobakterien auf diesen Medien zu fördern, wird während der Kultivierung eine Atmosphäre mit erhöhtem Kohlendioxidgehalt (4–7 %) geschaffen. Zu diesem Zweck werden spezielle CO₂-Inkubatoren verwendet _. Die größte Entwicklung verzeichneten jedoch automatisierte Mykobakterien-Kultivierungssysteme: MGIT-BACTEC-960 und MB/Bact.

Eines dieser Systeme ist das MGIT-System (Mycobacteria Growth Indication Tube), eine Hightech-Entwicklung zur beschleunigten bakteriologischen Tuberkulosediagnostik und zur Bestimmung der Mykobakterienempfindlichkeit gegenüber First-Line-Medikamenten und einigen Second-Line-Medikamenten. MGIT ist für den Einsatz im VASTEC-960-Gerät konzipiert. Mikroorganismen werden in speziellen Reagenzgläsern mit einem flüssigen Nährmedium auf Basis eines modifizierten Middlebrook-7H9-Mediums kultiviert. Um das Wachstum von Mykobakterien zu stimulieren und das Wachstum fremder Mikroflora zu hemmen, werden MGIT Growth Supplement und eine Mischung antibakterieller PANTA-Medikamente verwendet.

Das Wachstum von Mikroorganismen wird optisch erfasst. Es basiert auf Fluoreszenz, die entsteht, wenn Mykobakterien während ihres Wachstums Sauerstoff verbrauchen. Ein sauerstoffabhängiger Fluorochromfarbstoff befindet sich am Boden eines speziellen Reagenzglases und ist mit einer Silikonschicht überzogen. Die Vermehrung von Mykobakterien führt zu einer Abnahme der Sauerstoffmenge im Reagenzglas und seiner Konzentration. Dies führt zu einer Zunahme der Fluoreszenz, die bei Bestrahlung des Reagenzglases mit ultraviolettem Licht sichtbar wird und von den im VASTES-960-Gerät integrierten Fotosensoren automatisch registriert wird. Die Lumineszenzintensität wird in Wachstumseinheiten (GU) erfasst. Wachstumsdaten werden automatisch in einen Computer eingegeben und können dort gespeichert werden. Die Computeranalyse von Wachstumskurven kann Informationen über das Vorhandensein verschiedener Mykobakterienpools, einschließlich nichttuberkulöser, liefern und hilft auch, die Wachstumseigenschaften von Mykobakterien zu bewerten.

Durch die Einführung solcher Systeme konnte die Wachstumszeit von Mykobakterien deutlich verkürzt werden. Sie beträgt durchschnittlich 11 Tage auf VASTEC-960 und 19 Tage auf MB/Bact gegenüber 33 Tagen auf einem Standard-Nährmedium. Es ist zu beachten, dass diese Systeme hochqualifiziertes Personal erfordern. Die Aussaat von Material auf Flüssigmedien erfolgt zwangsläufig auch auf dem Löwenstein-Jensen-Medium, das als Backup dient, falls Tuberkulose-Mykobakterien auf anderen Medien nicht wachsen.

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Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mykobakterien

Die Bestimmung des Spektrums und des Empfindlichkeitsgrades von Mykobakterien gegenüber Tuberkulosemedikamenten ist von großer klinischer Bedeutung sowie für die epidemiologische Beurteilung der Ausbreitung medikamentenresistenter Tuberkulose. Darüber hinaus ermöglicht uns die Überwachung der Arzneimittelresistenz, die Wirksamkeit des gesamten Tuberkuloseprogramms zu beurteilen und ist ein integraler Indikator für die Wirksamkeit aller Komponenten der Tuberkulosemaßnahmen.

Häufigkeit und Zeitpunkt der Arzneimittelempfindlichkeitstests:

• Vor Beginn der Behandlung ist einmalig die Behandlungsstrategie und -taktik festzulegen:
• Bei der Isolierung von Kulturen aus verschiedenen Materialien eines Patienten (Sputum, BAL, Urin, Exsudate, Liquor cerebrospinalis usw.) werden alle isolierten Stämme untersucht:
• am Ende der intensiven Behandlungsphase bei fehlender klinischer und radiologischer Dynamik:
• wenn eine Änderung des Behandlungsschemas erforderlich ist bei:
  • Fehlen von Sputumnegativität;
  • erneute Kultur nach Sputum-Negativität;
  • Ein starker Anstieg der AFB-Menge in einem Abstrich nach anfänglichem Abfall. Es ist bekannt, dass Mycobacterium tuberculosis-Stämme mit unterschiedlicher Arzneimittelempfindlichkeit aus Material eines Tuberkulosepatienten isoliert werden. Die Empfindlichkeit der Stämme gegenüber Tuberkulosemedikamenten kann sich hinsichtlich des Wirkstoffspektrums, des Ausmaßes, der Häufigkeit und der Geschwindigkeit der Resistenzentwicklung unterscheiden.

Der Grad der Arzneimittelresistenz von Mycobacterium tuberculosis wird nach festgelegten Kriterien bestimmt, die sich an der klinischen Bedeutung der Resistenz orientieren und von der Antituberkuloseaktivität des Arzneimittels, seiner Pharmakokinetik, der Konzentration in der Läsion, der maximalen therapeutischen Dosis usw. abhängen.

Die Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mykobakterien erfolgt derzeit mit mikrobiologischen Methoden:

• absolute Konzentrationen (Verdünnungsmethode auf festen oder flüssigen Nährmedien),
• Proportionen,
• Widerstandskoeffizient.

Normalerweise manifestiert sich Resistenz in Form eines visuell beobachteten Wachstums von Mycobacterium tuberculosis-Kolonien. Es gibt jedoch Methoden, die das Wachstum in den frühen Stadien der mykobakteriellen Zellteilung in Form von Farbreaktionen induzieren. Diese Methoden verkürzen die Testzeit von 3-4 auf 2 Wochen.

Die vom WHO-Chemotherapie-Komitee empfohlene Methode der absoluten Konzentration hat sich in Russland als einheitliche Methode durchgesetzt. Methodisch gesehen ist sie die einfachste, erfordert jedoch eine hohe Standardisierung und Präzision der Laborverfahren. Der Arzneimittelempfindlichkeitstest besteht aus einem Satz Reagenzgläser mit einem mit Tuberkulosemedikamenten modifizierten Nährmedium. Das Set besteht aus 2–3 Reagenzgläsern mit unterschiedlichen Konzentrationen der einzelnen Medikamente, einem Kontrollreagenzglas mit einem Medium ohne das Medikament und einem Reagenzglas mit 1000 μg/ml Natriumsalicylat oder 500 μg/ml Paranitrobenzoesäure zum Nachweis des Wachstums nichttuberkulöser Mykobakterien.

Zur Herstellung eines Mediensatzes mit Präparaten wird ein modifiziertes Lowenstein-Jensen-Medium (ohne Stärke) verwendet, das in Kolben gegossen wird. Jedem Kolben wird ein bestimmtes Volumen der entsprechenden Verdünnung des Tuberkulosemedikaments zugesetzt. Der Kolbeninhalt wird gründlich gemischt, in Reagenzgläser gegossen und 40 Minuten bei einer Temperatur von 85 °C in geneigter Position koaguliert. Es wird empfohlen, das Medium in einem elektrischen Koagulator mit automatischer Temperaturregelung zu koagulieren. Medium mit Tuberkulosemedikamenten

Die 1. Reihe kann im Kühlschrank bei 2–4 °C einen Monat lang gelagert werden, die 2. Reihe maximal zwei Wochen. Die Lagerung von Medien mit Arzneimitteln bei Raumtemperatur ist nicht zulässig. Bei der Herstellung von Lösungen von Tuberkulosemedikamenten wird deren Aktivität berücksichtigt, indem die Konzentration unter Berücksichtigung des Molekulargewichts des unspezifischen Anteils des Arzneimittels, der Reinheit usw. berechnet wird. Zur Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit werden ausschließlich chemisch reine Substanzen verwendet.

Das Prinzip der Methode besteht darin, die Konzentration eines Tuberkulosemedikaments zu bestimmen, das das Wachstum eines signifikanten Teils der Mykobakterienpopulation hemmt. Bei korrekter Durchführung weist diese Methode eine hohe Zuverlässigkeit auf.

Vor der Durchführung des Tests muss sichergestellt werden, dass die isolierte Kultur von Mycobacterium tuberculosis keine fremde Mikroflora enthält. Aus der Kultur der Mykobakterien in einer 0,9%igen Natriumchloridlösung wird eine homogene Suspension mit 500 Millionen Mikrobenkörpern in 1 ml (optischer Trübungsstandard 5 Einheiten) hergestellt. Die resultierende Suspension wird mit 0,9%iger Natriumchloridlösung verdünnt (1:10) und 0,2 ml der Suspension werden zu jedem Reagenzglas des Nährmediensatzes hinzugefügt. Die beimpften Reagenzgläser werden in einen Thermostat bei 37 °C gestellt und 2–3 Tage lang horizontal gehalten, sodass die schräge Oberfläche des Nährmediums gleichmäßig mit der Suspension von Mycobacterium tuberculosis beimpft wird. Dann werden die Reagenzgläser in eine vertikale Position gebracht und 3–4 Wochen lang inkubiert. Die Ergebnisse werden nach 3–4 Wochen dokumentiert.

Da die Isolierung des Erregers aus klinischem Material auf Nährmedien mindestens 1–1,5 Monate dauert, können die Ergebnisse der Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit mit dieser Methode frühestens 2–2,5 Monate nach der Aussaat des Materials vorliegen. Dies ist einer der Hauptnachteile der Methode.

Die Ergebnisse der mykobakteriellen Arzneimittelempfindlichkeitsprüfung werden anhand bestimmter Kriterien interpretiert. Auf festen Medien gilt eine Kultur als empfindlich gegenüber der im Medium enthaltenen Arzneimittelkonzentration, wenn die Anzahl der in einem Reagenzglas mit dem Arzneimittel gewachsenen mykobakteriellen Kolonien 20 nicht überschreitet und in einem Kontrollreagenzglas ohne Arzneimittel reichliches Wachstum zu beobachten ist. Erst bei mehr als 20 Kolonien gilt die Kultur als resistent gegenüber einer bestimmten Konzentration. In der Praxis ist es bei Wachstumsergebnissen in Reagenzgläsern nahe 20 KBE erforderlich, die klinische Abteilung über die Grenzempfindlichkeit bzw. Resistenz zu informieren, da dies manchmal die unklare Dynamik klinischer Indikatoren erklären kann.

Für verschiedene Präparate wird eine bestimmte Konzentration festgelegt, bei der die Vermehrung eines kritischen Anteils der Mykobakterienpopulation beobachtet wird. Diese Konzentrationen werden als „kritisch“ bezeichnet. Das Ausmaß des Wachstums der Mykobakterienpopulation auf einem Nährmedium mit dem Präparat in einer kritischen Konzentration wird als Stabilitätskriterium verwendet.

In der häuslichen phthisiologischen Praxis beschränkt man sich bei der Bestimmung von Arzneimittelresistenzen nicht nur auf die Bestimmung kritischer Konzentrationen. Dies liegt daran, dass eine erweiterte Definition des Resistenzniveaus des Erregers es dem Kliniker ermöglicht, Chemotherapietaktiken korrekter zu formulieren, das Wissen über die potenzierende Wirkung von Arzneimittelkombinationen zu nutzen, Kreuzresistenzen vorherzusehen oder wirksamere Medikamente aus der Gruppe der verwendeten Tuberkulosemedikamente einzusetzen.

Die Methode der absoluten Konzentration ist die einfachste, aber auch die empfindlichste Methode gegenüber Fehlern bei ihrer Anwendung. Zuverlässiger, insbesondere bei der Bestimmung der Sensitivität gegenüber Zweitlinienmedikamenten, und außerhalb Russlands weit verbreitet ist die Proportionalitätsmethode. Sie berücksichtigt die Nachteile der Methode der absoluten Konzentration, ist jedoch in der Anwendung aufwändiger.

Die Methode ist der Methode der absoluten Konzentration sehr ähnlich. Die Vorbereitung der Reagenzgläser mit den Arzneimitteln erfolgt auf dieselbe Weise wie bei der Methode der absoluten Konzentration. Die Saatdosis der Tuberkulose-Mykobakterien-Suspension wird jedoch um das Zehnfache reduziert, wodurch die Häufigkeit einer spontanen Resistenz einiger Tuberkulose-Mykobakterienstämme gegen Arzneimittel wie Ethambutol, Prothionamid und Capreomycin eliminiert wird. Als Kontrollen werden 2 oder 3 Röhrchen mit einer Saatdosis gleich der in den Reagenzgläsern, sukzessive 10- und 100-fach verdünnt, verwendet. Das Kriterium für Resistenz ist der Anteil des visuell erkennbaren Wachstums des Tuberkulose-Mykobakteriums. Bei Arzneimitteln der ersten Wahl ist das Resistenzkriterium ein Überwachstum von 1 % der Ausgangspopulation, bei Arzneimitteln der zweiten Wahl ein Wachstum von 1 oder mehr als 10 % der Ausgangspopulation, abhängig von der gewählten kritischen Konzentration.

Im Jahr 1997 nahm die Arbeitsgruppe der WHO und der Internationalen Union gegen Tuberkulose zur Erkennung von Resistenzen gegen Tuberkulosemedikamente Anpassungen an diesen Kriterien vor und schlug vor, Mykobakterien, die auf dem dichten Lowenstein-Jensen-Eimedium in den folgenden Konzentrationen wachsen, als resistent zu betrachten:

• Dihydrostreptomycin – 4 μg/ml;
• Isoniazid – 0,2 µg/ml:
• Rifampicin – 40 µg/ml:
• Ethambutol – 2 µg/ml.

Im Jahr 2001 wurden kritische Konzentrationen für die folgenden Zweitlinienmedikamente vorgeschlagen (für einen kritischen Anteil von 1 %):

• Capreomycin – 40 µg/ml;
• Protionamid – 40 µg/ml;
• Kanamycin – 30 μg/ml;
• Viomycin – 30 μg/ml;
• Cycloserin – 40 µg/ml;
• Aminosalicylsäure – 0,5 µg/ml;
• Ofloxacin – 2 µg/ml.

Die Wachstumsergebnisse werden nach 4 Wochen als vorläufig und nach 6 Wochen Kultivierung als endgültig beurteilt.

Zur Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit gegenüber Pyrazinamid, das in der modernen Tuberkulose-Chemotherapie weit verbreitet ist, beträgt die empfohlene kritische Konzentration 200 μg/ml. Es gibt jedoch noch keine allgemein anerkannte Methode zur Bestimmung der Arzneimittelresistenz gegen dieses Medikament auf festen Nährmedien, da sich seine antibakterielle Aktivität nur in einem sauren Milieu (pH < 6) entfaltet, das technisch schwer aufrechtzuerhalten ist. Zudem zögern viele klinische Kulturen von Mycobacterium tuberculosis, auf Ei-Nährböden mit saurem Milieu zu wachsen.

Um die Qualität der Ergebnisse der Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mykobakterien zu beurteilen, wird empfohlen, jede neue Charge des Löwenstein-Jensen-Mediums durch parallele Bestimmung der Empfindlichkeit des Standard-Museumsstamms H37Rv zu kontrollieren. Darüber hinaus müssen bestimmte mikrobiologische Kriterien erfüllt sein, damit die Methoden ein gut reproduzierbares und korrekt interpretiertes Ergebnis liefern. Dazu gehören die Lebensfähigkeit der Tuberkulose-Mykobakterienkultur, die Regeln zur Gewinnung einer homogenen Suspension und Suspension, die Regeln zur Auswahl der Tuberkulose-Mykobakterienkulturen und die Repräsentativität der ausgewählten Bakterienmasse. Die Zuverlässigkeit der Bestimmung der Arzneimittelresistenz nimmt bei extrem schlechter Bakterienausscheidung ab.

In jüngster Zeit wurde die Methode zur Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit mithilfe automatisierter Systeme als vielversprechend erkannt. Am fortschrittlichsten auf diesem Gebiet sind Entwicklungen auf Basis von VASTEC MGIT-960. Dabei wird die Arzneimittelempfindlichkeit tuberkulöser Mykobakterien anhand einer modifizierten Proportionalitätsmethode bestimmt. Bei der Bestimmung wird die Wachstumsrate der tuberkulösen Mykobakterien im Kontrollröhrchen und in den Röhrchen mit Arzneimitteln verglichen. Zur Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber Streptomycin, Isoniazid, Rifampicin und Ethambutol werden anreichernde Zusätze und Antibiotika aus dem SIRE-Kit verwendet. Zur Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber Pyrazinamid wird das PZA-Kit verwendet. Während des Tests werden Reagenzgläser mit Arzneimitteln mit einer Suspension tuberkulöser Mykobakterien beimpft, sowie Kontrollröhrchen mit einer 100-fachen Verdünnung der Suspension für alle Arzneimittel, mit Ausnahme von Pyrazinamid, bei dem die Suspension 10-fach verdünnt wird. Als Stabilitätskriterium gilt ein Mykobakterien-Wachstumsindikator von 100 GU, wenn das Wachstum im Kontrollröhrchen 400 GU erreicht (siehe „Kulturelle Methoden zur Isolierung von Mykobakterien“). Die Ergebnisse werden automatisch aufgezeichnet und interpretiert und durch das eingegebene oder ausgewählte Programm festgelegt.

Die Endkonzentrationen im Reagenzglas mit flüssigem Nährmedium werden als kritische Konzentrationen verwendet. Derzeit wurden kritische Konzentrationen sowohl für First-Line-Medikamente als auch für einige Second-Line-Medikamente entwickelt. Es ist zu beachten, dass die Bestimmung der Empfindlichkeit von Tuberkulose-Mykobakterien gegenüber Cycloserin und Aminosalicylsäure nur auf Ei-Nährmedien durchgeführt wird.

Ein detailliertes Protokoll für das beschriebene System ermöglicht die Prüfung der Arzneimittelempfindlichkeit sowohl an einer isolierten Kultur (mit dichtem Nährmedium) als auch am primären Wachstum von Mykobakterien in einem MGIT-Reagenzglas. Letztere Option reduziert den Zeitaufwand für Kulturstudien erheblich und ermöglicht vollständige Ergebnisse der Kultur von Tuberkulose-Mykobakterien (einschließlich Informationen zur Arzneimittelempfindlichkeit) innerhalb von 3 Wochen nach der Materialentnahme, während dies mit der herkömmlichen Methode erst nach 3 Monaten möglich ist. Zeitnahe Ergebnisse, wenn sich der Patient in der intensiven Behandlungsphase befindet, können die relativ hohen Kosten der Studien kompensieren.

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Differenzierung von Mykobakterien

Da die verwendeten Nährmedien nicht streng selektiv sind, ist eine anschließende Differenzierung der isolierten Mykobakterien zwingend erforderlich. Die Notwendigkeit einer Differenzierung von Mykobakterien ergibt sich aus einer Reihe von Besonderheiten der pathologischen Prozesse, die durch Vertreter dieser Gattung verursacht werden: unterschiedlicher Verlauf und Ausgang von Tuberkulose und Mykobakteriose sowie das Vorhandensein natürlicher Arzneimittelresistenzen gegen einige Tuberkulosemedikamente.

Es ist anerkannt, dass die primäre Identifizierung von Mykobakterien des M. tuberculosis-Komplexes von nichttuberkulösen Mykobakterien anhand der folgenden Merkmale erfolgt: Wachstumsrate auf dichten Nährmedien, Pigmentbildung, Koloniemorphologie, Vorhandensein von Säureresistenz und optimale Temperatur für das Wachstum.

Leider gibt es keine einzige Labormethode, mit der Mykobakterien des M. tuberculosis-Komplexes zuverlässig von anderen säurefesten Mykobakterien unterschieden werden können. Eine Kombination der oben beschriebenen Anzeichen mit den Ergebnissen einer Reihe unten aufgeführter biochemischer Tests ermöglicht jedoch die Identifizierung von Mykobakterien des M. tuberculosis-Komplexes mit einer Wahrscheinlichkeit von bis zu 95 %.

Um Mykobakterien des M. tuberculosis-Komplexes (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii und andere) von langsam wachsenden nichttuberkulösen Mykobakterien zu unterscheiden, werden grundlegende biochemische Tests verwendet, um das Vorhandensein der folgenden Anzeichen festzustellen:

• Fähigkeit zur Produktion von Nicotinsäure (Niacin-Test):
• Nitratreduktaseaktivität;
• thermostabile Katalase;
• Wachstum auf einem Medium mit Natriumsalicylat (1 mg/ml).

Als zusätzlicher Test können auch Wachstumstests auf einem Medium mit 500 μg/ml Para-Nitrobenzoesäure oder 5 % Natriumchlorid verwendet werden.

Viele bakteriologische Labore identifizieren diese Mikroorganismen nur auf komplexer Ebene, was auf die begrenzten Kapazitäten der Labore und die methodischen Fähigkeiten der Spezialisten zurückzuführen ist.

In der Praxis reichen in den meisten Fällen folgende Tests zur Unterscheidung zwischen M. tuberculosis und M. bovis aus: Niacin, Nitratreduktase, Pyrazinamidase und Wachstumsregistrierung auf einem Medium mit 2 μg/ml Thiophen-2-carbonsäurehydrazid. Dabei wird berücksichtigt, dass Mykobakterien des M. tuberculosis-Komplexes durch folgende Merkmale charakterisiert sind:

• langsames Wachstum (mehr als 3 Wochen);
• Wachstumstemperatur im Bereich von 35–37 ^° C;
• Fehlen einer Pigmentierung (Elfenbeinfarbe);
• ausgeprägte säurefeste Färbung;
• positiver Niacin-Test;
• positiver Nitratreduktasetest;
• Fehlen von thermostabiler Katalase (68 ^° C).
• fehlendes Wachstum auf Lowenstein-Jensen-Medium mit:
  • 1000 µg/ml Natriumsalicylsäure,
  • 500 mcg/ml Para-Nitrobenzoesäure,
  • 5% Natriumchlorid:
• Wachstum in Gegenwart von 1–5 μg/ml Thiophen-2-carbonsäure.

Die Bedeutung der Differenzierung isolierter Mykobakterien wird mit der zunehmenden Häufigkeit von HIV/AIDS-Fällen im Zusammenhang mit Tuberkulose oder Mykobakteriose deutlich zunehmen. Derzeit besteht keine absolute Gewissheit, dass die regionalen Laboratorien in der Lage sind, dieses Arbeitsvolumen korrekt zu bewältigen.

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Immunologische Diagnostik der Tuberkulose

Es gibt eine Reihe universeller Phänomene, Präparate und immunologischer Tests, die ursprünglich speziell bei Tuberkulose oder im Modell der Immunantwort auf Mykobakterien entdeckt wurden. Dazu gehören BCG und Tuberkulin, Phänomene wie der Haut-DST (Tuberkulintests – Pirquet- und Mantoux-Reaktionen) und die Reaktion auf subkutane Verabreichung von Tuberkulin an sensibilisierte Tiere (Koch-Phänomen). Einige der ersten Antikörper gegen Infektionskrankheiten wurden ebenfalls bei Tuberkulose entdeckt. Je tiefer das Verständnis der Mechanismen der Anti-Tuberkulose-Immunität und ihrer genetischen Kontrolle ist, desto breiter können immunologische Methoden und Präparate, die die Immunität beeinflussen, zur Lösung praktischer Probleme der Phthisiologie eingesetzt werden.

Als wichtigstes und komplexestes praktisches Problem gilt derzeit der Nachweis von Tuberkulose im Rahmen von Massenscreenings der Bevölkerung. Trotz zahlreicher Erfolgsberichte (anhand begrenzter Daten) gibt es jedoch keine immunologische Methode (reproduzierbar in „jeder Hand“) oder ein für diese Zwecke geeignetes Medikament.

Immunologische Methoden, insbesondere serologische Untersuchungen (Bestimmung von Antigenen, Antikörpern) und Tuberkulin-Provokationstests, finden in der klinischen Praxis breite Anwendung.

Serologische Methoden, die Antigene und Antikörper in verschiedenen Körperumgebungen bestimmen, stehen bei den immunologischen Untersuchungen zur Differentialdiagnostik an erster Stelle.

Die Spezifität der Bestimmung von Antikörpern gegen Mycobacterium tuberculosis hängt von den in der Immunanalyse verwendeten Antigenen ab. Es wurde eine beträchtliche Anzahl von Antigenen vorgeschlagen, von denen das erste Tuberkulin PPD ist:

• PPD und andere komplexe Präparate aus Kulturflüssigkeit;
• Ultraschall-Desintegrator;
• Triton-Extrakt und andere komplexe Zellwandpräparate;
• 5-Antigen (Daniel);
• 60-Antigen (Coccito);
• Lipoarabinomannan;
• Cordfaktor (Trehalose-6,6-di-mycolat);
• Phenol- und andere Glykolipide;
• Lipopolysaccharide;
• Fibronektin-bindendes Antigen;
• Proteine (meistens rekombinant); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 KDA usw.

Als Ergebnis langjähriger Forschung russischer und ausländischer Wissenschaftler wurden die Hauptmuster der Antikörperbildung und die Effektivität der serologischen Tuberkulosediagnostik identifiziert: Je komplexer das Antigen, desto höher die Sensitivität und desto geringer die Spezifität der Tests. Die Spezifität variiert in verschiedenen Ländern je nach Infektion der Bevölkerung mit M. tuberculosis und nichttuberkulösen Mykobakterien, der BCG-Impfung etc. Bei Kindern ist die Aussagekraft der Serodiagnostik geringer als bei Erwachsenen. Bei primärer Tuberkulose (häufiger bei Kindern) ist die Bestimmung von IgM aussagekräftiger, bei sekundärer Tuberkulose IgG. Bei HIV-Infizierten ist die Aussagekraft der Serodiagnostik zur Antikörperbestimmung reduziert. Die Effektivität der Antikörperbestimmung hängt von einer Reihe „klinischer Momente“ ab: der Aktivität des Prozesses (Anwesenheit oder Abwesenheit einer „Isolierung“ von Mykobakterien, Vorhandensein von Karieshöhlen, Infiltrationsgrad), der Prävalenz des Prozesses und der Dauer seines Verlaufs.

Die Sensitivität des Enzymimmunoassays (EIA) liegt bei etwa 70 %. Die unzureichende Wirksamkeit der Studie ist auf ihre geringe Spezifität zurückzuführen. Zuvor wurden die Möglichkeiten des serologischen Screenings bei Hochrisikogruppen erwogen, insbesondere bei Menschen mit posttuberkulösen Lungenveränderungen.

Um die Spezifität von ELISA zu erhöhen, wird nach spezifischeren Antigenen gesucht, darunter solchen, die durch Gentechnik gewonnen werden: ESAT-6 usw. (siehe oben). Die Verwendung streng spezifischer Antigene (38 kDa, ESAT) erhöht die Spezifität, verringert jedoch die Sensitivität der Analyse erheblich. Neben ELISA (experimentelle Labortestsysteme wie das Pathozyme ELISA-Kit) werden auch immunchromatographische Kits mit Lateralfiltration (Mycodot) sowie andere ähnliche Tests (Membran-Dot-Analyse) mit visueller Auswertung des Testergebnisses angeboten. Die Durchführung dieser Tests dauert 10–30 Minuten; sie erfordern keine spezielle Ausrüstung, sondern eine visuelle Auswertung der Ergebnisse, die mit einer gewissen Subjektivität verbunden ist. Diese Methoden haben in etwa die gleichen Sensitivitäts- und Spezifitätsmerkmale (70 % bzw. 90–93 %) wie herkömmliche ELISA.

Der Einsatz immunanalytischer Methoden hat einen gewissen Stellenwert als zusätzliche Methode im Methodenkomplex der Differentialdiagnose der Tuberkulose, insbesondere bei der Diagnose ihrer extrapulmonalen Formen. Die ELISA-Methode ist bei der Diagnose einer tuberkulösen Meningitis am effektivsten, wenn die Zerebrospinalflüssigkeit untersucht wird. In diesem Fall beträgt die Sensitivität der Analyse 80–85 % und die Spezifität 97–98 %. Es liegen Informationen zur Wirksamkeit der Bestimmung von Antikörpern gegen Mycobacterium tuberculosis in der Tränenflüssigkeit bei der Diagnose einer tuberkulösen Uveitis vor.

Induktion der Gamma-Interferonsynthese in vitro

Gamma-Interferon (IFN-γ) ist ein Faktor des spezifischen Immunschutzes, der durch die Aktivierung der Enzymsysteme von Makrophagen realisiert wird. Die Induktion der IFN-γ-Synthese durch sensibilisierte T-Lymphozyten wird durch deren Interaktion mit mykobakteriellen Antigenen verursacht.

Als Antigene werden sowohl Tuberkulin-PPD als auch spezifische gentechnisch gewonnene Antigene verwendet, insbesondere das ESAT-6-Antigen (früh sezerniertes Antigen mit einem Molekulargewicht von 6 kDa) und CFP-10 (Kulturfiltratprotein, 10 kDa). Gentechnisch veränderte oder rekombinante Antigene fehlen in den Zellen des BCG-Impfstoffs und anderer Mykobakterien. Bei Verwendung von Tuberkulin sind die Ergebnisse des IFN-γ-Induktionstests mit den Ergebnissen des Tuberkulin-Hauttests vergleichbar (direkte Korrelation). Bei Verwendung gentechnisch veränderter Antigene sind die Testergebnisse spezifischer und hängen nicht von einer vorherigen BCG-Impfung ab. Bei der Untersuchung geimpfter Personen, die keinen Kontakt mit einer Tuberkulose-Infektion hatten, beträgt die Spezifität des Tests 99 %. Die Sensitivität des Tests bei Tuberkulose-Patienten liegt zwischen 81 und 89 %.

Es wurden Tests und Diagnostika entwickelt, die auf der kurzfristigen Kultivierung von Vollblutzellen oder aus Blut isolierten mononukleären Zellen mit Tuberkulose-Mykobakterien-Antigenen in vitro basieren. Anschließend wird die IFN-γ-Konzentration bestimmt oder die Anzahl der IFN-γ synthetisierenden T-Lymphozyten gezählt. Die Konzentration des im Reagenzglas synthetisierten Interferons wird mittels ELISA unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die IFN-γ binden, bestimmt. Anschließend wird mittels Kalibrierung von Standard-IFN-γ dessen Konzentration im Reagenzglas oder in den Vertiefungen der Platte bestimmt.

Beim Elispot-Test wird die Anzahl der IFN-γ synthetisierenden T-Zellen auf der Oberfläche einer mit Antikörpern gegen IFN-γ beschichteten Schale gezählt.

Die Entwickler des von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassenen In-vitro-IFN-γ-Induktionsdiagnostikums geben an, dass der Test nicht zwischen einer latenten Tuberkulose-Infektion und einer aktiven Tuberkulose unterscheiden kann. Daher hat der Test in Regionen mit hoher Infektionsrate keinen direkten diagnostischen Wert. In unserem Land kann er jedoch verwendet werden, um eine Tuberkulose-Infektion bei Kindern von einer Impfallergie zu unterscheiden und den Grad der spezifischen Immunität während der Behandlung zu beurteilen.

Derzeit wird ein inländisches Testsystem zur Bestimmung der Induktion der IFN-γ-Synthese durch spezifische Tuberkulose-Antigene in vitro untersucht.

Immunstatus und Verlauf der Tuberkulose, Immunkorrektur

Während der Behandlung einer Tuberkulose kommt es bei Menschen zu Veränderungen der Antigenämie und des Zustands des Immunsystems.

Die Daten zu Veränderungen in Exsudaten und Geweben sind weitgehend widersprüchlich. Das einzige, was mit voller Berechtigung festgestellt werden kann, ist, dass tuberkulöse Granulome in der Regel eine signifikante Anzahl aktivierter T-Lymphozyten enthalten.

Es ist sinnvoll, auf zwei weitere Punkte einzugehen, die zum Verständnis der Rolle immunologischer Mechanismen bei der Behandlung von Tuberkulose beim Menschen notwendig sind:

• Bei AIDS-Patienten kommt es besonders häufig zu einer Entwicklung von multiplen Arzneimittelresistenzen.
• Bei multipler Arzneimittelresistenz (und ohne HIV-Infektion) sind Immunstörungen (vor allem der T-Zell-Immunität) von besonderer Bedeutung.

Bei Tuberkulose werden häufig verschiedene Methoden der Immunkorrektur eingesetzt: Zunächst handelt es sich dabei um Medikamente, die hauptsächlich auf die T-Zell-Immunität und das mononukleäre Phagozytensystem wirken (Thymushormone, Isophon, Licopid, Polyoxidonium usw.), sowie ganze (abgeschwächte) Mykobakterien und ihre Bestandteile.

Molekularbiologische Diagnostik der Tuberkulose

Molekularbiologische Methoden in der Infektionsdiagnostik umfassen vor allem Methoden, die auf der Manipulation des Genommaterials bakterieller und viraler Pathogene basieren, um spezifisches genetisches Material zu identifizieren – DNA-Abschnitte mit einer für eine bestimmte Art oder einen bestimmten Stamm des Pathogens spezifischen Nukleotidsequenz –, spezifische DNA-Sequenzen in Genen zu analysieren, die die Empfindlichkeit des Pathogens gegenüber bestimmten Medikamenten bestimmen, sowie die funktionelle Aktivität bestimmter Gene des Pathogens zu analysieren. Molekularbiologische Methoden haben sich seit der Entdeckung der Polymerase-Kettenreaktion 1985 durch Carrie Mullis (Nobelpreisträgerin 1989) in der wissenschaftlichen Forschung und praktischen Anwendung in der Diagnostik und Überwachung verschiedener bakterieller und viraler Infektionen weit verbreitet.

Prinzipien und Möglichkeiten der Polymerase-Kettenreaktion

Die PCR ermöglicht die millionenfache Amplifikation (Vervielfältigung) einer Nukleotidsequenz (eines Fragments der pathogenen DNA) im Reagenzglas innerhalb weniger Stunden. Die Durchführung der Reaktion in Gegenwart einzelner DNA-Stränge bestimmt die außergewöhnlich hohe Sensitivität der Analyse.

Die Nukleotidsequenz bestimmter Abschnitte der DNA-Kette bestimmt die genetische Einzigartigkeit des Mikroorganismus, was die hohe Spezifität der PCR erklärt.

Die Bedeutung dieser Methode für den Nachweis und die Untersuchung der Eigenschaften von Mycobacterium tuberculosis liegt in den biologischen Eigenschaften des Mikroorganismus, der sehr langsam wächst: Die Verdopplungszeit der DNA von Mycobacterium tuberculosis während der Kultivierung beträgt 12–24 Stunden.

Das Prinzip der PCR-Methode ist die Amplifikation – die mehrfache, millionenfache Vervielfältigung von Abschnitten einer bestimmten DNA-Sequenz in einem Reagenzglas-Mikrovolumen mit zyklischer Wiederholung der folgenden drei Reaktionsschritte, die jeweils in einem anderen Temperaturregime stattfinden:

• Stufe I – Denaturierung doppelsträngiger DNA beim Erhitzen mit Divergenz ihrer Ketten;
• Stufe II – komplementäre Bindung (Hybridisierung) von Primern (Priming-Oligonukleotiden) mit den Endabschnitten der Ketten eines streng spezifischen DNA-Fragments, das zur Amplifikation ausgewählt wurde;
• Stufe III – Vervollständigung der DNA-Fragmentkette mittels thermostabiler DNA-Polymerase.

Zur Amplifikation muss das Reagenzglas Matrix-DNA-Moleküle enthalten. Vier Arten von Desoxynukleosidtriphosphaten (Nukleotiden) mit den entsprechenden stickstoffhaltigen Basen: Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G), Cytosin (C); künstlich synthetisierte Priming-Oligonukleotide (Primer) bestehend aus 18–20 Basenpaaren; ein thermostabiles Enzym, DNA-Polymerase, mit einem Temperaturoptimum von 68–72 ^° C und Magnesiumionen.

Die Spezifität der PCR hängt von der Wahl des DNA-Fragments ab. Entsprechend werden flankierende Primer-Oligonukleotide synthetisiert. Die Spezifität der Hybridisierung und Vervollständigung der DNA-Kette wird durch das Prinzip der Komplementarität der folgenden Stickstoffbasenpaare bestimmt: Adenin-Thymin, Guanin-Cytosin.

Zur Bestimmung des Genoms der Tuberkulose-Mykobakterien ist das DNA-Fragment IS6110 in den meisten Testsystemen das effektivste Amplifikationsziel. Es weist in den meisten Stämmen der Tuberkulose-Mykobakterien eine signifikante Anzahl (10–20) von Wiederholungen im Genom auf, was neben der Spezifität auch eine hohe Sensitivität der Analyse gewährleistet. Gleichzeitig wurden Tuberkulose-Mykobakterienstämme mit einer geringen Anzahl von Wiederholungen oder dem Fehlen des IS6110-Fragments beschrieben.

Extraktion von DNA-Molekülen aus einer biologischen Probe

Um eine PCR durchzuführen, müssen die DNA-Moleküle des Erregers in einem minimalen Volumen aus dem biologischen Material isoliert werden, mit einer minimalen Menge unspezifischer DNA und verschiedenen Inhibitoren des Enzyms DNA-Polymerase.

Die Probenvorbereitung muss unter Bedingungen erfolgen, die eine Kreuzkontamination der untersuchten Proben mit isolierten DNA-Molekülen verhindern. Dies erfordert eine Vorbehandlung des Raumes mit ultraviolettem Licht, des Bodens und der Arbeitsflächen von Tischen und Geräten – mit chlorhaltigen Lösungen. Außerdem sind saubere Handschuhe, Einweg-Reagenzgläser und Spitzen für automatische Pipetten erforderlich.

Um die DNA von Mycobacterium tuberculosis aus klinischen Proben (Liquor cerebrospinalis, Bronchiallavage) zu isolieren, die keine große Zahl an Leukozyten, Zelltrümmern oder Salzen enthalten, genügt es, die Probe bei 3.000 – 4.000 Umdrehungen pro Minute zu zentrifugieren, dem Sediment 20 – 30 µl einer 2%igen Lösung von Triton X-100 zuzusetzen und 30 Minuten lang auf 90 ^° C zu erhitzen.

Die Sputumprobenvorbereitung erfordert eine effiziente Verflüssigung, typischerweise mit 4%iger Natriumhydroxidlösung und 50–80 mg N-Acetyl-L-Cystein (NALC) pro Probe, abhängig von der Probenviskosität. Die NALC-Lösung sollte sofort zubereitet werden, oder NALC-Pulver kann trocken direkt zur Probe hinzugefügt werden. Nach der Verflüssigung sollten die Proben 15 Minuten lang bei 3.500–4.000 U/min (3.000 g) in 50-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss zentrifugiert werden, d. h. unter den gleichen Bedingungen wie für die Sputumvorkultur.

Zur Extraktion von DNA aus Sedimenten wird am häufigsten eine Methode verwendet, die auf der Verwendung einer 5- bis 6-molaren Guanidinisothiocyanatlösung als Lysemittel und mikroporöser Siliziumoxidpartikel („Kieselgur“) basiert, die DNA-Moleküle sorbieren. Unspezifische Substanzen, einschließlich möglicher Inhibitoren, werden anschließend in einer 2,5-molaren Guanidinisothiocyanatlösung und einer Ethanollösung gewaschen. Anschließend werden die DNA-Moleküle in Wasser desorbiert und diese Proben zur PCR verwendet. Um die Technologie der DNA-Extraktion zu vereinfachen, wird „Kieselgur“ häufig durch magnetische, mit Siliziumoxid beschichtete Mikropartikel ersetzt. In diesem Fall wird anstelle einer Zentrifugation ein spezieller Magnetständer für Mikroröhrchen verwendet, um die Partikel auszufällen.

In Russland wurde eine neuartige Methode zur immunomagnetischen Trennung von Mykobakterien mit anschließender Extraktion der pathogenen DNA entwickelt. Zur immunomagnetischen Trennung von Tuberkulose-Mykobakterien werden 3–5 µm große, mit Siliziumoxid beschichtete Ferropartikel verwendet, an die polyklonale (Kaninchen-)Antikörper gegen Tuberkulose-Mykobakterien chemisch gebunden sind. Sputumproben werden nach der alkalischen Lyse mit einer sauren Tris-HCl-Lösung neutralisiert und mit einem immunomagnetischen Sorbens inkubiert. Anschließend werden die Immunferropartikel mit einem Magnetstab mit austauschbarer Spitze gesammelt, in ein Mikroröhrchen überführt und präzipitiert. 20–30 µl einer 2%igen Triton X-100-Lösung werden hinzugefügt und 30 Minuten auf 90 ^° C erhitzt. Der Überstand dient als DNA-Matrix für die PCR-Analyse.

Die Extraktion von Tuberkulose-Mykobakterien-DNA aus Biopsieproben ist ein schwieriges Problem. Zur Lyse der Biopsie wird das Enzym Proteinase K in einer Endkonzentration von 200–500 mg/l bei 56 ^° C über Nacht eingesetzt. Anschließend wird die DNA mit einer der bekannten Methoden extrahiert. Überschüssige unspezifische DNA in der PCR-Analyse von Biopsieproben führt häufig zu einer Hemmung der Reaktion, was eine wiederholte DNA-Extraktion erforderlich macht.

Methoden zur Ergebniserkennung

Nach Abschluss der Reaktion werden die amplifizierten Fragmente der Erreger-DNA mit verschiedenen Methoden identifiziert.

Die Gelelektrophorese ist eine bekannte Methode. Dabei wird das erhaltene DNA-Fragment durch eine Positivkontrolle, die das gewünschte spezifische DNA-Fragment enthält, oder durch eine zuvor bekannte Größe (Anzahl der Nukleotidpaare) des Fragments identifiziert, die mithilfe eines Standard-Molekülmarkers bestimmt wird.

In Gegenwart eines spezifischen Farbstoffs – Ethidiumbromid, der in doppelsträngiger DNA enthalten ist – wird das synthetisierte DNA-Fragment als Band sichtbar, das unter dem Einfluss von ultraviolettem Licht leuchtet.

Die Größe des DNA-Fragments, die durch Elektrophorese anhand der vom Startpunkt zurückgelegten Distanz bestimmt wird, muss einem bekannten Molekulargewichtsmarker oder einer positiven Kontrolle entsprechen.

Andere Methoden zur Bestimmung von PCR-Ergebnissen basieren auf der Hybridisierung einzelsträngiger PCR-Produkte mit einem komplementären Oligonukleotid – einer mit Biotin markierten DNA-Sonde, gefolgt von einer Detektion mittels einer enzymatischen Reaktion, beispielsweise durch Bindung eines Streptavidin-alkalischen Phosphatase-Konjugats an Biotin.

Basierend auf dieser Art der Erkennung wurden PCR-Analysatoren entwickelt, bei denen die Erkennung der PCR-Ergebnisse automatisch durch Ablesen der optischen Dichte in Proben nach der enzymatischen Reaktion erfolgt.

Zu den Nachteilen dieser Methoden gehört die Möglichkeit einer Kontamination innerhalb des Labors mit relativ kurzen DNA-Molekülfragmenten. Wenn diese Moleküle in neu getestete Proben gelangen, werden sie zur Matrix für die PCR und führen zu falsch positiven Ergebnissen.

Um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, gelten strenge Regeln für die Trennung und Isolierung von Räumen: für die DNA-Extraktion aus biologischen Proben; Räume für die Ergebniserfassung (Elektrophorese) vom Reinraum. Diese Räume stellen einen Bereich wahrscheinlicher Kontamination dar. Ein weiterer isolierter Bereich ist ein Reinraum, in dem die zu untersuchenden DNA-Proben in Reagenzgläser mit dem Reaktionsgemisch für die PCR gegeben werden. Schließlich wird davon ausgegangen, dass das Hauptgerät – der DNA-Verstärker – in einen separaten Raum, möglicherweise einen Büroraum, gebracht werden sollte.

Um eine Kontamination durch Produkte früherer Reaktionen – Amplikons – zu verhindern, enthalten einige PCR-Testsysteme anstelle von Desoxynukleosidthymidin Desoxynukleosiduridin. Dieses wird während der In-vitro-Kettensynthese an der entsprechenden Stelle eingebaut, d. h. die in nativer DNA vorhandene stickstoffhaltige Base Thymin wird durch Uracil ersetzt. Dem Reaktionsgemisch des analysierten Materials zugesetzte Uracil-DNA-Glykosylase zerstört nur kontaminierende Fragmente mit Desoxyuridin, nicht jedoch die native, Desoxythymidin enthaltende DNA. Anschließendes Erhitzen auf 94 ^° C inaktiviert dieses Enzym und beeinträchtigt die Amplifikation in der PCR nicht.

Es gibt ein Testsystem, das auf der isothermen Amplifikation von rRNA basiert. Dabei werden zunächst die reverse Transkription und die Synthese von DNA-Molekülen durchgeführt, die wiederum die Matrix für die anschließende Synthese von RNA-Molekülen bilden. RNA-Amplifikate werden während der Hybridisierung in einer Reaktionsgefäßlösung mithilfe einer Acridin-gefärbten DNA-Sonde nachgewiesen. Diese Methode bietet neben der hohen Sensitivität den Vorteil, dass die Analyse in einem einzigen Röhrchen durchgeführt werden kann, was Kontaminationen verhindert. Laut den Autoren erreicht die Sensitivität dieser Methode in Atemwegsproben 90 % bei einer Spezifität von 99–100 %.

Neue Nachweismethoden werden in der Echtzeit-PCR implementiert. Diese Verfahren unterscheiden sich hauptsächlich darin, dass PCR und Nachweis gleichzeitig in einem geschlossenen Reagenzglas durchgeführt werden. Dies vereinfacht nicht nur die Analyse technologisch, sondern verhindert auch die Kontamination von Laborräumen und Proben durch Produkte der vorherigen PCR.

Bei der Echtzeit-PCR werden die Ergebnisse durch Fluoreszenz detektiert, die durch die Hybridisierung einer fluorogenen DNA-Sonde mit einem spezifischen, während der PCR amplifizierten DNA-Fragment entsteht. Die Struktur fluorogener DNA-Sonden ist so aufgebaut, dass der Fluoreszenzmarker erst bei spezifischer Hybridisierung mit dem gewünschten, während der PCR amplifizierten DNA-Molekül durch eine enzymatische Reaktion freigesetzt wird bzw. sich vom Fluoreszenzlöschermolekül entfernt. Mit zunehmender Anzahl der mit der Sonde hybridisierten Moleküle ist der Anstieg der Fluoreszenz bis zu einem detektierbaren Niveau proportional zur Anzahl der Moleküle des amplifizierten Produkts. Da sich die Anzahl der DNA-Fragmentmoleküle während jedes PCR-Zyklus verdoppelt, ist die Zyklenzahl, ab der Fluoreszenz detektiert wird und zunimmt, umgekehrt proportional zur Anzahl der DNA-Moleküle in der ursprünglichen Probe. Werden mehrere unterschiedliche bekannte Konzentrationen von Molekülen des entsprechenden Tuberkulose-Mykobakterien-DNA-Fragments als Kalibrator in die Reaktion eingebracht, lässt sich die Anzahl der DNA-Genome im untersuchten Material mithilfe eines Computerprogramms berechnen.

Jede Standardprobe wird dupliziert. Das quantitative Kriterium ist die Mindestzahl von PCR-Zyklen, die für das Einsetzen und Ansteigen nachweisbarer Fluoreszenz erforderlich sind. Die Abszissenachse stellt die Zyklenzahl dar, die Ordinatenachse den Fluoreszenzwert. DNA-Konzentrationen sind umgekehrt proportional zur Anzahl der Zyklen, die für das Auftreten von Fluoreszenz erforderlich sind. Die Fenster in der rechten Spalte (21-32) zeigen die Zyklenzahlen für die entsprechenden Konzentrationen. Die Unterschiede zwischen 10-fachen Konzentrationen von DNA-Fragmenten ( ^102-106 ml ) betragen 3,2-3,4 Zyklen. Bei zwei Patienten lagen die Konzentrationen der IS6110-Fragmente bei etwa 103 ^/ ml und 104 ^/ ml. Unter Berücksichtigung der Anzahl der Wiederholungen (6-20) der analysierten Fragmente im Genom von Mycobacterium tuberculosis beträgt die Anzahl von Mycobacterium tuberculosis in den klinischen Proben etwa 100 bzw. 1000 Zellen.

Anwendung der PCR in der Tuberkulosediagnostik

Die PCR-Methode wird vor allem zur Schnelldiagnose von Tuberkulose eingesetzt – zum Nachweis von Mycobacterium tuberculosis in klinischen Proben: Sputum, Bronchialspülungen, Pleuraexsudat, Urin, Liquor cerebrospinalis, Osteolysepunktionen, Aspiraten des weiblichen Genitaltrakts und verschiedenen Biopsien. In einer Studie in Holland mit etwa 500 Sputum- und Bronchialspülungen von 340 Patienten mit bestätigter Diagnose Lungentuberkulose wurde die vergleichende Sensitivität der PCR-, Kultur- und Abstrichmikroskopie-Methoden untersucht. Die Sensitivität der Analyse betrug 92,6 %, 88,9 % bzw. 52,4 %. Die Spezifität aller Methoden lag bei etwa 99 %.

Die Nachweiseffizienz von Mycobacterium tuberculosis wurde mittels Ausstrichmikroskopie, Aussaat auf Löwenstein-Jensen-Medium, dem VASTES-Testsystem und PCR-Analyse verglichen. Die PCR wies eine Sensitivität von 74,4 % auf, die Mikroskopie von 33,8 %, die Aussaat auf festem Medium von 48,9 % und VASTES von 55,8 %. Die durchschnittliche Nachweiszeit für die Aussaat auf Löwenstein-Jensen-Medium beträgt 24 Tage. VASTES: 13 Tage, PCR: 1 Tag.

Außerdem wird das Potenzial der Verwendung der PCR als empfindliche und schnelle Methode zur Überwachung der Wirksamkeit der Tuberkulosebehandlung diskutiert.

Der Nachweis von Mycobacterium tuberculosis-DNA mittels PCR-Methode wird bei wirksamer Chemotherapie über einen längeren Zeitraum ermittelt – im Durchschnitt 1,7 Monate im Vergleich zur fluoreszenzmikroskopisch ermittelten Bakterienausscheidung und 2,5 Monate im Vergleich zur bakteriologischen Untersuchung.

Diagnose extrapulmonaler Formen der Tuberkulose

Die Bedeutung der PCR als sensitive Methode ist insbesondere bei extrapulmonalen Formen groß, da gerade bei diesen Formen klinische und radiologische Methoden sowie traditionelle bakteriologische Methoden zum Nachweis von Mycobacterium tuberculosis in diagnostischen Materialien wirkungslos sind.

Bei der Untersuchung von Urinproben waren die Ergebnisse der PCR-Analyse bei 16 von 17 Patienten mit aktiver Tuberkulose der ableitenden Harnwege positiv und bei 4 Patienten mit inaktiver Nierentuberkulose sowie 39 Patienten mit nichttuberkulösen Erkrankungen der ableitenden Harnwege negativ.

Die Effizienz der PCR-Analyse wurde bei der Untersuchung von Knochenmarkaspiraten bei Patienten mit Fieber unbekannter Genese und Verdacht auf tuberkulöse Natur der Erkrankung nachgewiesen. Zur Diagnose einer tuberkulösen Lymphadenitis bei Kindern wurden 102 Punktionsaspirate und Biopsieproben von 67 Kindern mit Verdacht auf tuberkulöse Lymphadenitis untersucht. Positive Ergebnisse wurden erzielt: durch Echtzeit-PCR – 71,6 %, Fluoreszenzmikroskopie – 46,3 %, Kulturuntersuchung – 41,8 %. Bei der Untersuchung von 50 Lymphknotenbiopsien von Patienten mit Katzenkratzkrankheit waren alle Ergebnisse negativ. Somit wurde eine 100-prozentige Spezifität der PCR-Analyse nachgewiesen. In derselben Arbeit wurde die Möglichkeit des Nachweises von M. avium in einer Punktionsbiopsie von Lymphknoten gezeigt.

Die Diagnose weiblicher Genitaltuberkulose bei Unfruchtbarkeit zählt zu den schwierigsten diagnostischen Problemen. Bei 14 (56 %) von 25 laparoskopisch untersuchten Patientinnen mit Tuberkuloseverdacht lieferten PCR-Untersuchungen von Endometriumbiopsien, Endometriumaspiraten und Douglas-Pouch-Flüssigkeitsproben positive Ergebnisse. Ausstrichmikroskopie und Kulturuntersuchungen ergaben jeweils ein bzw. zwei positive Ergebnisse. Diese Fälle waren ebenfalls PCR-positiv. Die meisten PCR-positiven Ergebnisse gab es bei Fällen mit charakteristischen Merkmalen einer Tuberkulose laut histologischer Untersuchung; eine geringere Anzahl betraf Fälle mit Tuberkuloseverdacht laut Laparoskopie. Nur ein positives PCR-Ergebnis wurde ohne laparoskopische Tuberkulose-Befunde erzielt.

Bei der Diagnose extrapulmonaler Formen der Tuberkulose stellen sich Kliniker häufig die Frage nach der Möglichkeit, den Erreger bei der Untersuchung von Blutproben mittels PCR zu identifizieren. Literaturdaten deuten darauf hin, dass der Nachweis von Mycobacterium tuberculosis-DNA in Blutproben bei fortgeschrittenen Formen der HIV-Infektion möglich ist. Mycobacterium tuberculosis-DNA wurde nur bei generalisierter Tuberkulose verschiedener Organe bei Patienten mit transplantierter Niere und Immunsuppression nachgewiesen.

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Artidentifizierung von Mykobakterien

Die PCR-Methode kann für die schnelle Identifizierung von Mykobakterien des Tuberkulosekomplexes und einiger Arten nichttuberkulöser Mykobakterien nach Erreichen ihres primären Wachstums recht effektiv sein. In diesem Fall können durch den Einsatz der PCR 7–10 Tage eingespart werden, die für die anschließende kulturelle Identifizierung eines positiven Ergebnisses erforderlich wären. Die PCR-Studie ist technisch sehr einfach, da zur Erzielung einer hohen Sensitivität keine aufwändige Probenvorbereitung des klinischen Materials erforderlich ist. Bei der Untersuchung von 80 positiven Kulturen in einem solchen Testsystem (MB BacT von Organon) waren alle positiven PCR-Analyseergebnisse streng spezifisch und wurden innerhalb eines Tages durchgeführt. Um andere Arten von Mykobakterien zu identifizieren, wenn sie in Kultur gewonnen werden, wird die Erreger-DNA mit spezifischen, mit Acridin markierten DNA-Sonden hybridisiert und die Stämme werden durch das Auftreten von Chemilumineszenz unter Verwendung eines Chemiluminometers oder auf Nitrozellulosestreifen mit visueller Beurteilung nach der Hybridisierung nachgewiesen. Dieses Kit identifiziert eine begrenzte Anzahl von Arten: Mycobacterium tuberculosis-Komplex, M. avium, M. avium-Komplex, M. kansasii und M. gordonae.

A. Telenti et al. entwickelten außerdem eine relativ einfache und kostengünstige Methode zur Artidentifizierung klinisch wichtiger Mykobakterien, die auf PCR und anschließender Behandlung mit zwei Restriktionsenzymen (Enzyme, die ein DNA-Molekül an spezifischen Stellen schneiden können) basiert. Dabei wird ein DNA-Fragment, das für ein Hitzeschockprotein (65 kDa) kodiert, amplifiziert und das durch PCR erhaltene, 439 Nukleotidpaare lange DNA-Fragment separat mit zwei Enzymen – Bste II und Nae III – behandelt. Anschließend werden die beiden erhaltenen Produkte mittels Agarosegelelektrophorese analysiert und ihre Größe (Anzahl der Nukleotidpaare) anhand eines Satzes von Standard-DNA-Fragmenten (molekulare DNA-Marker) mit einer Länge von 100 bis 1000 Nukleotidpaaren bestimmt. In jeder der definierten Arten (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum) werden für jedes Restriktionsenzym 2 oder 3 unterschiedlich große DNA-Fragmente gefunden. Durch die Kombination der dabei entstehenden DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe lassen sich diese Arten voneinander unterscheiden.

Derzeit wird eine Technologie für biologische DNA-Mikroarrays entwickelt, mit deren Hilfe in einer einzigen Studie über 100 Mykobakterienarten identifiziert werden können.

Die Artidentifizierung kann auch mittels PCR-Amplifikation der variablen Region der 16S-rRNA und anschließender Sequenzierung der Amplicons im Vergleich mit der entsprechenden Primärstruktur durchgeführt werden, wodurch die Identifizierung von mehr als 40 Mykobakterienarten ermöglicht wird.

Die PCR kann auch zur Identifizierung von Arten innerhalb des Tuberkulose-Mykobakterienkomplexes verwendet werden, einschließlich der Differenzierung zwischen M. bovis und M. bovis BCG. Dies geschieht durch die Analyse des Vorhandenseins oder Fehlens bestimmter Gene in den Genomregionen RD1, RD9 und RD10. RD1 fehlt in M. bovis BCG, ist jedoch in virulenten Arten, einschließlich M. bovis, vorhanden.

Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mycobacterium tuberculosis mittels PCR

Die Aufgaben molekulargenetischer Methoden zur Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit oder -resistenz von Mycobacterium tuberculosis beschränken sich auf die Identifizierung von Mutationen in bestimmten Nukleotidsequenzen bekannter Gene. Die Hauptmethoden basieren entweder auf dem direkten Lesen (Sequenzieren) dieser Sequenzen nach Amplifikation oder auf der Hybridisierung biotinmarkierter DNA-Fragmente, die während der PCR amplifiziert wurden, mit DNA-Sonden. Beide Optionen beinhalten die Identifizierung von Substitutionen in Nukleotidsequenzen, die bei Verwendung von DNA-Sonden zu einer fehlenden oder unvollständigen Hybridisierung auf einer Nitrocellulosemembran unter Verwendung eines Enzymkonjugats (Streptavidin-alkalische Phosphatase) führen – der LIPA-Rif-TB-Methode.

Die Methode zur Messung der Fluoreszenz lokal fixierter DNA-Sonden auf Mikroregionen, die komplementär zu bekannten Mutationen in PCR-amplifizierten Genregionen sind, die für die Arzneimittelempfindlichkeit oder -resistenz verantwortlich sind, wird als Mikrobiochip-Methode bezeichnet. Der grundlegende Algorithmus zur Durchführung dieser Studie ist wie folgt. Nachdem DNA aus einer klinischen Probe oder mykobakteriellen Kultur isoliert wurde, muss eine PCR durchgeführt werden, um die entsprechenden Fragmente des groB-Gens zu amplifizieren, das für die Arzneimittelempfindlichkeit gegenüber Rifampicin verantwortlich ist, oder der katG- und inhA-Gene, die für mykobakterielle Proteine kodieren, die für die Empfindlichkeit gegenüber Isoniazid verantwortlich sind. Die PCR-Ergebnisse werden mittels Agarosegelelektrophorese ausgewertet, die den Erhalt der entsprechenden DNA-Fragmente der gewünschten Länge bestätigt. Dann wird eine zweite PCR-Runde durchgeführt, um eine fluoreszierende Markierung in die DNA einzuführen. Die PCR-Ergebnisse werden erneut durch Gelelektrophorese bestätigt. Anschließend erfolgt die Hybridisierung (Inkubation über Nacht) mit anschließendem Waschen des erhaltenen Materials auf einem Biochip. Dabei handelt es sich um eine große Anzahl kurzer DNA-Ketten (Sonden), die auf einer kleinen Glasplatte fixiert sind und komplementär zu den Nukleotidsequenzen des medikamentenempfindlichen Typs der Tuberkulose-Mykobakterien an den Stellen möglicher Mutationen sowie zu den für die Arzneimittelresistenz verantwortlichen mutierten Sequenzen sind. Die Position der DNA-Sonden auf der Platte ist genau definiert, und der während der Hybridisierung beobachtete Fluoreszenzpegel wird zur Bestimmung des Ergebnisses mit einem speziellen Lesegerät ermittelt. Die Ergebnisse der Analyse werden dabei mit einem speziellen Computerprogramm ermittelt.

In den letzten Jahren wurden alternative Methoden zur Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mycobacterium tuberculosis entwickelt, die auf der Echtzeit-PCR-Technologie basieren und die Durchführung dieser Studien in einem geschlossenen Reagenzglas ermöglichen.

Abbildung 13-13 zeigt das Ergebnis der Analyse klinischer Kulturen von Mycobacterium tuberculosis bei der Bestimmung der Arzneimittelresistenz gegen Rifampicin mittels Echtzeit-PCR: 218 – Kontrollprobe (empfindlich gegenüber Rifampicin); 93 – positive Kontrolle für die Ser-Trp TCG-TGG-Mutation; 4482 – positive Kontrolle für die Ser-Leu TCG-TTG-Mutation; 162-322 – experimentelle Proben. Das Ergebnis der Berechnung der kinetischen Amplifikationskurven für 4 Kanäle: Kanal 1: 393 – positive Kontrolle für die Ser-Trp TCG-TGG-Mutation; Kanal 2: 4482 – positive Kontrolle für die Ser-Leu TCG-TTG-Mutation; 162, 163, 172, 295 – experimentelle Proben; Kanal 4: kinetische Amplifikationskurven aller am Experiment beteiligten Proben. Positive Kontrolle der Amplifikationsreaktion. Schlussfolgerungen: Die Analyse ergab die folgenden Mutationen, die die Resistenz gegen Rifampicin bestimmen: in den Proben 162, 163, 172 und 295 – Ser-Leu TCG-TTG. Das gleiche Prinzip wurde verwendet, um die Arzneimittelresistenz gegen Isoniazid durch die Gene katG und inhA zu bestimmen, die die häufigsten Mutationen bestimmen.

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Stammidentifizierung von Mycobacterium tuberculosis

Die am besten untersuchte Methode zur Stammidentifizierung von Mycobacterium tuberculosis ist eine Technologie namens Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), die auf der Fragmentierung (Restriktion) der DNA von Mycobacterium tuberculosis durch das Enzym Pvu II und der darauf folgenden Hybridisierung der erhaltenen Fragmente mit bestimmten Sequenzen auf der DNA seines Wiederholungselements IS6110 beruht. Die intraspezifische Variabilität wird durch die unterschiedliche Anzahl und Lage der IS6110-Wiederholungen auf der DNA sowie die unterschiedlichen Abstände zwischen bestimmten Angriffspunkten des Restriktionsenzyms (Restriktionsstellen) und dem IS6110-Element erreicht. Diese Technologie ist sehr komplex und arbeitsintensiv. Nach der Behandlung der aus der Kultur des Mykobakteriums Tuberkulose isolierten DNA mit einem Restriktionsenzym wird eine Gelelektrophorese durchgeführt, dann werden DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, mit Fragmenten des IS6110-Elements hybridisiert und die Ergebnisse werden mithilfe einer enzymatischen Reaktion detektiert. Das resultierende spezifische Bandenmuster charakterisiert die DNA eines bestimmten Tuberkulosemykobakterienstammes. Die Computeranalyse zeigt die Identität oder Verwandtschaft der Stämme. Obwohl die RFLP-Methode die beste Trennschärfe aufweist und die meisten Unterschiede zwischen den analysierten Stämmen aufdeckt, ist sie bei einer geringen Anzahl (weniger als 5) von IS6110-Wiederholungen, die bei einigen Stämmen beobachtet werden, unwirksam. Abbildungen 13-14 zeigen die Ergebnisse der RFLP-Typisierung der Stämme.

Eine Alternative könnte die Spoligotypisierungsmethode sein – die Analyse des Polymorphismus von Spacer-DNA-Sequenzen – zwischen direkten Wiederholungen der DR-Region. Bei der Spoligotypisierung von Stämmen wird eine PCR mit Primern durchgeführt, die die DR-Region begrenzen. Anschließend werden Fragmente unterschiedlicher Länge gebildet, die mit variablen DNA-Zwischenregionen hybridisieren. Die Analyse von Spacer-Sequenzen der DR-Region erscheint den Forschern zufolge einfacher, produktiver und geeigneter für das primäre Screening von Stämmen und vorläufige epidemiologische Analysen sowie für die direkte Untersuchung von klinischem Material.

Eine offensichtlich effektivere und technologisch zugänglichere Methode ist VNTR (Abkürzung englischer Wörter), also die Methode zur Bestimmung der variablen Anzahl exakter Tandem-Wiederholungen in der DNA von Mycobacterium tuberculosis. Diese Methode basiert ausschließlich auf der PCR und erfordert keine zusätzlichen Manipulationen. Da die Anzahl der Tandem-Wiederholungen in verschiedenen Stämmen und an verschiedenen Loci unterschiedlich ist, werden Fragmente unterschiedlicher Größe im resultierenden Elektrophoregramm der PCR-Produkte bestimmt und analysiert. Laut Forschern wird mit Hilfe von VNTR ein höherer Grad an Unterscheidung der Stämme erreicht als mit der RFLP-Methode.

In den letzten Jahren wurde der Verbreitung von Mycobacterium tuberculosis-Stämmen der W-Beijing-Familie (manchmal auch als Beijing-Stamm bezeichnet) große Aufmerksamkeit gewidmet, die weitgehend medikamentenresistent sind.

Grundanforderungen an die Qualität molekularbiologischer Forschung

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Wichtige regulatorische Dokumente zur Durchführung von PCR

Anordnungen des Gesundheitsministeriums der Russischen Föderation: Nr. 45 vom 07.02.2000; Nr. 109 vom 21.03.2003; Nr. 64 vom 21.02.2000. Richtlinien: 1.3.1888-04 „Arbeitsorganisation bei der PCR-Untersuchung von Material, das mit pathogenen biologischen Agenzien der Pathogenitätsgruppen III-IV infiziert ist“; 1.3.1794-03 „Arbeitsorganisation bei der PCR-Untersuchung von Material, das mit Mikroorganismen der Pathogenitätsgruppen I-II infiziert ist“. 2003; 3.5.5.1034-01 „Desinfektion von mit Bakterien der Pathogenitätsgruppen I-IV infiziertem Untersuchungsmaterial bei der Arbeit mit der PCR-Methode“, 2001. Anhang 11 zu den Anweisungen über einheitliche Methoden der mikrobiologischen Forschung zum Nachweis, zur Diagnose und zur Behandlung von Tuberkulose.

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Personal

Molekularbiologische Untersuchungen können von Ärzten für klinische Labordiagnostik, Bakteriologen, Virologen, Biologen für klinische Labordiagnostik sowie von Fachärzten mit medizinischer Sekundarausbildung durchgeführt werden, die eine Spezialisierung und Weiterbildung in der vorgeschriebenen Weise absolviert haben.

Anordnung der Laborräume

Folgende Laborausstattung wird benötigt:

• Probenverarbeitungsbereich – ein Labor, das für die Arbeit mit Infektionserregern der Pathogenitätsgruppen III-IV gemäß den Methodischen Richtlinien 13.1888-04 angepasst ist.
• Der Bereich zur Herstellung von PCR-Reaktionsgemischen ist ein Laborraum, der Schutz vor laborinterner Kontamination bietet – ein „sauberer“ Bereich.
• • Wird zur Analyse von PCR-Produkten Elektrophorese oder Hybridisierung verwendet, muss der Laborraum, in dem die amplifizierten DNA-Fragmente aus dem Amplifikationsröhrchen extrahiert werden und somit in die Umwelt gelangen können, gemäß den Anforderungen für PCR-Labore (Methodologische Richtlinien 1.3.1794-03, Methodologische Richtlinien 1.3.1888-04) vollständig von den in den vorherigen Absätzen genannten Räumen isoliert sein. Der Transport von Personal, Geräten, Materialien und Gegenständen vom Elektrophoresebereich in den Probenverarbeitungsbereich und den „sauberen“ Bereich sowie der Luftaustausch durch das Lüftungssystem oder durch Zugluft müssen ausgeschlossen sein. Für die fluorimetrische Detektion von PCR-Produkten wird dieser Bereich nicht benötigt.
• Der Raum zur Dokumentation und Verarbeitung der Ergebnisse ist mit Computern und der notwendigen Büroausstattung ausgestattet. Dieser Raum kann Geräte enthalten, die den Nachweis von PCR-Produkten ohne Öffnen des Röhrchens gewährleisten, z. B. Fluoreszenz-PCR-Detektoren und Thermocycler für Echtzeit-PCR.

Die hygienischen und epidemiologischen Anforderungen für die primäre Verarbeitung von Sputum ähneln den standardmäßigen mikrobiologischen Anforderungen für die Arbeit mit Mycobacterium tuberculosis.

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Komplette Laborausstattung für die PCR-Diagnostik

Das Labor-Set beinhaltet die Ausstattung folgender Räume.

• Probenvorbereitungsraum, enthält folgende Ausstattung: Laminar-Flow-Haube der Schutzklasse II „SP-1.2“: Festkörperthermostat mit beheiztem Deckel für Eppendorf-Reagenzgläser; Mikrozentrifuge mit 13.000 U/min; Zentrifuge („Vortex“); Kühlschrank mit einem Temperaturbereich von -20 ^° C bis +10 ^° C; Pipetten mit variablem Volumen der Serie „Proline“; Pumpe mit Trap-Flasche OM-1; Pipettenständer; Arbeitsplatzständer 200 x 0,5 ml; Arbeitsplatzständer 50 x 1,5 ml; Ständer zur Aufbewahrung von Reagenzgläsern 80 x 1,5 ml;
• Raum zur Vorbereitung des Reaktionsgemisches: Schutzkammer PCR-Box ("Laminar-C. 110 cm); Zentrifuge "Vortex"; Pipetten mit variablem Volumen der Serie "Proline"; Pipettenständer; Arbeitsplatzständer 200 x 0,2 ml; Ständer zur Aufbewahrung von Reagenzgläsern 80 x 1,5 ml; Kühlschrank mit einem Temperaturbereich von -20 ^° C bis +10 ^° C;
• Elektrophoreseraum: horizontale Elektrophoresekammer; Stromquelle; Transilluminator;
• DNA-Verstärker oder Nukleinsäureanalysator (Echtzeit-PCR) mit Computer und Software; kann in jedem verfügbaren Raum aufgestellt werden. Bei Verwendung der Echtzeit-PCR-Technologie ist kein Elektrophoreseraum erforderlich.

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Externe Qualitätskontrolle

Um sicherzustellen, dass sie objektiv zuverlässige Ergebnisse erzielen, müssen Labore an einem System zur externen Bewertung der Qualität der Laborforschung teilnehmen.

Teilnehmer am Qualitätskontrollsystem erhalten: 12 Ampullen mit lyophilisierten Suspensionen von Bakterienzellen, davon zwei mit E. coli, 3 Ampullen mit tuberkulösen Mykobakterien (avirulenter Stamm) in einer Konzentration von 10 ² /ml; 3 Ampullen mit Zellen eines ähnlichen Stammes in einer Konzentration von 10 ⁴ /ml; jeweils 2 Ampullen mit nichttuberkulösen Mykobakterien M. avium-intracellulare und M. kansasii in einer Konzentration von 10 ⁵ /ml.

Die zur externen Qualitätsbewertung eingesendeten Tests werden in zwei unabhängigen Laboren mit umfassender Erfahrung auf diesem Gebiet vorgeprüft.

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