Ein Fläschchen, zwei Ziele: Tragbare CRISPR-basierte Tuberkulosediagnose mit 100 % Sensitivität

In Science Advances wurde ein Artikel über einen tragbaren Tuberkulosetest veröffentlicht, der ohne komplexe Geräte direkt aus Sputum durchgeführt werden kann. Isotherme DNA-Amplifikation und CRISPR-Messung werden in einem einzigen Reagenzglas kombiniert; zwei konservative M. tuberculosis-Insertionen (IS6110 und IS1081) werden gleichzeitig getestet, plus ein menschliches Gen als interne Probenkontrolle. In einem kleinen „Blindtest“ an klinischen Proben ergab der Test eine 100%ige Sensitivität (6/6) und 100%ige Spezifität (7/7) im Vergleich zur Kultur; die Nachweisgrenze liegt bei ~69–81 KBE/ml in simuliertem Sputum. Das Ergebnis ist auf einem Papierteststreifen sichtbar, und die Reagenzien werden lyophilisiert (Aufbewahrung ohne „Kühlkette“).

Hintergrund

Laut WHO werden im Jahr 2023 rund 1,25 Millionen Menschen an Tuberkulose sterben. Mit geschätzten 10,8 Millionen Fällen ist Tuberkulose erneut die häufigste infektiöse Todesursache. Daher ist eine zugängliche und schnelle Diagnostik besonders in ressourcenarmen Regionen von entscheidender Bedeutung.

• Aktuelle Tests stellen einen Kompromiss zwischen Genauigkeit, Geschwindigkeit und Preis dar. Die „Goldstandard“-Kultur ist sehr genau, aber langsam; die Mikroskopie ist schnell, aber unempfindlich; PCR-Plattformen wie Xpert MTB/RIF Ultra sind deutlich empfindlicher (LOD ≈ 15,6 KBE/ml), erfordern aber teure Geräte und Kartuschen, was die Abdeckung einschränkt.
• Warum isotherm und CRISPR? Die isotherme RPA-Amplifikation funktioniert bei 37–42 °C und erfordert keine Thermocycler – praktisch im Feld. Die CRISPR-Auslesung (Cas12/13) erhöht die Speziesspezifität und ermöglicht visuellen Lateral Flow („Streifen“) ohne komplexe Optik. Insgesamt ist dies der Weg zu tragbaren und kostengünstigen PVR-Tests.
• Warum zwei MBT-Ziele gleichzeitig (IS6110 + IS1081). IS6110 ist ein Multicopy-Insert des M. tuberculosis- Komplexes, einige Linien enthalten jedoch nur wenige Kopien, sodass Tests auf IS6110 allein möglicherweise „fehlschlagen“. Das Hinzufügen eines zweiten IS1081-Inserts verringert das Risiko falsch-negativer Ergebnisse.
• Warum interne menschliche Kontrolle? Atemproben können Inhibitoren und „schlechte“ Proben enthalten. Eine endogene menschliche Kontrolle (z. B. RNase P/genomische DNA) bestätigt, dass das Material geeignet ist und die Reaktion nicht unterdrückt wird – andernfalls kann das Ergebnis nicht als negativ gewertet werden.
• Das Eintopfformat ist an sich schon wichtig. Es reduziert die Anzahl der Schritte, verringert das Kontaminationsrisiko und erleichtert die Arbeit außerhalb des Labors. Solche Ansätze für TB haben sich bereits als praktikabel erwiesen; die neue Arbeit erweitert die Idee auf ein Dual-Target-Format mit internen Kontrollen und demonstriert zudem die Gefriertrocknung von Reagenzien und ein Streifenlesegerät.
• Welchen Wert hat der vorliegende Artikel? Die Autoren demonstrierten die Erkennung direkt aus dem Sputum nach der einfachsten Probenvorbereitung, die Nachweisgrenze bei ~70–80 KBE/ml in simuliertem Sputum und eine 100%ige Sensitivität/Spezifität bei einer kleinen Blindprobe klinischer Proben – eine gute „Tech-Demo“ für weitere multizentrische Validierungen.

Wie funktioniert das

• Die Wissenschaftler kombinierten RPA (Rapid Isothermal Amplification of Genetic Material at 37 °C) mit den Schneideenzymen Cas13a/Cas12a. Nach Auswahl der Leit-RNAs konfigurierten sie das System so, dass es zwei MBT-Ziele gleichzeitig und parallel zur menschlichen DNA anvisierte (wobei sie überprüften, ob die Probe überhaupt Material enthielt und die Reaktion nicht ins Stocken geraten war).
• Die gesamte Chemie kommt in ein Reagenzglas; nach der Inkubation wird das Ergebnis entweder mit einem Fluorimeter oder auf einem Lateral-Flow-Streifen abgelesen – im Wesentlichen wie bei einem Expresstest.
• Die Sputumverarbeitung wurde auf Erhitzen und kurzes Zentrifugieren vereinfacht – ohne Nukleinsäureextraktoren. Für die eingeschränktesten Bedingungen diskutieren die Autoren sogar manuelle Alternativen zur Zentrifuge.

Was die Tests zeigten

• Nachweisgrenze: 69,0 KBE/ml (Stamm H37Rv) und 80,5 KBE/ml (BCG) im „Spike“-Sputum. Es wurde keine Kreuzreaktivität mit anderen Bakterien/Pilzen festgestellt.
• Klinischer Rahmen (verblindete Proben): Bei 13 Proben aus der Praxis – 100 % Sensitivität (6/6) und 100 % Spezifität (7/7) im Vergleich zur Aussaat. Zum Vergleich: Mit demselben Kit zeigte GeneXpert Ultra 100 % bzw. 86 %.
• Technische Nuancen: Von den beiden Leseoptionen funktionierte Cas13a besser (im „One-Pot“-Format ist es sensitiver als Cas12a). Außerdem verringert das parallele Testen zweier Mtb-Ziele das Risiko falscher Ergebnisse.

Warum ist das notwendig?

Heutige Tests stellen einen Kompromiss zwischen Genauigkeit, Geschwindigkeit und Verfügbarkeit dar: Kulturen sind sehr genau, aber langsam; Abstriche sind schnell, aber ungenau; PCR-Systeme wie GeneXpert sind zwar genau und schnell, erfordern aber teure Instrumente und Kartuschen. Der neue CRISPR-Ansatz soll diese Lücke schließen: Felddiagnostik bei 37 °C, mit Papierstreifenmessung und der Möglichkeit, Reagenzien ungekühlt zu lagern.

Einschränkungen und was als nächstes kommt

Dies ist eine frühe Demonstration in einem kleinen klinischen Set – umfangreiche, multizentrische Tests sind erforderlich (einschließlich HIV-Koinfektionen bei Kindern, mit paucibazillären Formen und verschiedenen MBT-Linien). Die Autoren weisen gesondert darauf hin, dass in der „Feld“-Version selbst die Tischzentrifuge durch eine vollständig manuelle Lösung ersetzt werden muss. Die Architektur selbst – „zwei Targets + interne Kontrolle“ in einem Reagenzglas – hat jedoch bereits ihre Funktionsfähigkeit bewiesen und bietet einen klaren Weg zur Verfeinerung für den Masseneinsatz.

Quelle: Alexandra G. Bell et al. Ein optimierter CRISPR-basierter Test zur Tuberkulose-Erkennung direkt aus Sputum, Science Advances, online, 6. August 2025 (Vol. 11, Ausgabe 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206