Hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut

Nabelschnurblut ist hinsichtlich seines proliferativen Potenzials und seiner Repopulationsfähigkeit eine gute Quelle für hämatopoetische Stammzellen. Es wurde wiederholt gezeigt, dass Nabelschnurblut zum Zeitpunkt der Geburt eine ausreichend große Anzahl schwach entwickelter hämatopoetischer Vorläuferzellen enthält. Einige Autoren glauben, dass der Vorteil der Transplantation hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut darin liegt, dass keine Suche nach einem HLA-Antigen-kompatiblen Spender erforderlich ist. Ihrer Ansicht nach führt die Unreife des Immunsystems des Neugeborenen zu einer verringerten funktionellen Aktivität immunkompetenter Zellen und dementsprechend zu einer geringeren Inzidenz schwerer Graft-versus-Host-Krankheit als bei einer Knochenmarktransplantation. Gleichzeitig ist die Überlebensrate einer Nabelschnurblutzelltransplantation nicht niedriger als die von Knochenmarkzellen, selbst wenn eine geringere Anzahl von HSZ pro 1 kg Körpergewicht des Patienten verabreicht wird. Unserer Meinung nach bedürfen jedoch die Fragen nach der optimalen Anzahl transplantierter Nabelschnurblutzellen, die für eine wirksame Einnistung in den Körper des Empfängers erforderlich sind, ihrer immunologischen Verträglichkeit und einer Reihe anderer Aspekte der Transplantation hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut einer gründlicheren Analyse.

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Gewinnung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut

Das Verfahren zur Gewinnung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut erfordert deren Entnahme unmittelbar nach der Geburt des Kindes und deren Ablösung von der Plazenta, wenn sich die Plazenta in oder außerhalb der Gebärmutter befindet, sowie während eines Kaiserschnitts, aber auch außerhalb der Gebärmutter. Es wurde nachgewiesen, dass sich das Volumen des gewonnenen Nabelschnurbluts um durchschnittlich 25–40 ml erhöht, wenn die Zeit vom Zeitpunkt der Geburt bis zur Ablösung des Neugeborenen von der Plazenta auf 30 Sekunden verkürzt wird. Wird dieser Vorgang später durchgeführt, geht die gleiche Menge Blut verloren. Es wurde festgestellt, dass eine frühe Ablösung des Kindes von der Plazenta keine negativen Folgen für das Neugeborene hat.

Das Russische Forschungsinstitut für Hämatologie und Transfusiologie hat wirksame und kostengünstige Technologien zur Gewinnung von Nabelschnurblut sowohl bei einer normalen Geburt ((70,2+25,8) ml) als auch bei einem Kaiserschnitt ((73,4+25,1) ml) entwickelt. Es wurde ein Verfahren zur Trennung von Nabelschnurblut mit einer ausreichend hohen Ausbeute an kernhaltigen und mononukleären Zellen vorgeschlagen – (83,1+9,6) bzw. (83,4+14,1) %. Ein Verfahren zur Kryokonservierung von Nabelschnurblut wurde verbessert, das eine hohe Konservierung von mononukleären Zellen und CFU-GM – (96,8+5,7) bzw. (89,6+22,6) % – gewährleistet. Die Effizienz der Drainagemethode zur Gewinnung von Nabelschnurblut unter Verwendung des Kompoplast-300-Behälters (Russland) wurde bestimmt. Die Autoren sammelten Nabelschnurblut unmittelbar nach der Geburt des Kindes und seiner Lösung von der Plazenta, unter den Bedingungen einer Plazentaplatzierung in utero oder ex utero. Vor der Punktion der Nabelvene wurde die Nabelschnur einmal mit 5%iger Jodtinktur und dann zweimal mit 70%igem Ethylalkohol behandelt. Das Blut floss spontan durch die Verbindungsschläuche in den Behälter. Der Sammelvorgang dauerte nicht länger als 10 Minuten. Das durchschnittliche Volumen von 66 durch Drainage gesammelten Nabelschnurblutproben betrug (72 + 28) ml, und die Anzahl der Leukozyten im durchschnittlichen Gesamtprobenvolumen betrug (1,1 + 0,6) x 107. Bei der Analyse des Nabelschnurbluts auf Sterilität (bakterielle Kontamination, HIV-1, Hepatitis B- und C-Viren, Syphilis und Cytomegalovirus-Infektion) wurden IgG-Antikörper gegen das Hepatitis C-Virus in nur einer Probe nachgewiesen. In einer anderen Studie wurde die Plazenta unmittelbar nach der Geburt mit der Oberfläche nach unten auf einen speziellen Rahmen gelegt und die Nabelschnur mit 5%iger Jodlösung und 75%igem Ethylalkohol behandelt. Die Nabelvene wurde mit einer Nadel aus einem Transfusionssystem (G16) drainiert. Das Blut floss spontan in den Behälter. Das durchschnittliche Volumen des auf diese Weise gesammelten Blutes betrug (55 + 25) ml. In der Arbeit von G. Kogler et al. (1996) wurde Nabelschnurblut mithilfe einer geschlossenen Methode gesammelt und große Blutvolumina gewonnen – im Durchschnitt (79 + 26) ml. Die Autoren weisen darauf hin, dass von 574 Nabelschnurblutproben etwa 7 % weniger als 40 ml Blut enthielten und daher nicht für Transplantationen verwendet werden können. K. Isoyama et al. (1996) sammelten Nabelschnurblut durch aktive Exfusion mit Spritzen und erhielten durchschnittlich 69,1 ml Blut (das Volumen des Nabelschnurbluts variierte zwischen 15 und 135 ml). Schließlich gelang es A. Abdel-Mageed PI et al. (1997), durch Katheterisierung der Nabelvene durchschnittlich 94 ml Nabelschnurblut (von 56 bis 143 ml) zu gewinnen.

Um das Risiko einer iatrogenen Infektion und einer Kontamination mit mütterlichen Sekreten zu verringern, wurde ein geschlossenes Blutentnahmesystem entwickelt, das auf dem weit verbreiteten Transfusionssystem der Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), basiert und 62,5 ml CPDA (Citrat-Phosphat-Dextrose mit Adenin) als Antikoagulans enthält. Die Technologie zur Gewinnung des Materials ist von größter Bedeutung für die Herstellung einer qualitativ hochwertigen Probe hinsichtlich Volumen, Inhalt und Reinheit der Zellsuspension. Von den bestehenden Methoden zur Gewinnung von Nabelschnurblut, die üblicherweise in geschlossene, halboffene und offene Systeme eingeteilt werden, ist ersterem der Vorzug zu geben, da das geschlossene System das Risiko einer mikrobiellen Kontamination des Materials sowie einer Kontamination der Zellsuspension mit mütterlichen Zellen erheblich reduziert.

A. Nagler et al. (1998) haben eine vergleichende Analyse der Effizienz aller drei Systeme zur Gewinnung von Nabelschnurblut durchgeführt. In der ersten Variante wurde das Verfahren in einem geschlossenen System durchgeführt, indem das Blut direkt in einen Behälter exfoliert wurde. In der zweiten Variante wurde Nabelschnurblut durch aktive Exfusion von Blut mit einer MP1-Spritze gewonnen, gefolgt vom Spülen der Plazentavenen und gleichzeitigem Ablassen des Bluts in einen Behälter (offene Methode). In der dritten Variante wurde Blut in einem halboffenen System gewonnen, indem es aktiv mit Spritzen extrahiert und durch die Nabelarterie gespült wurde, bei gleichzeitiger Exfusion in einen Behälter. In der ersten Variante gewannen die Autoren Nabelschnurblut in einem Volumen von (76,4 + 32,1) ml mit einem Leukozytengehalt von (10,5 + 3,6) x 10 ⁶ in 1 ml Blut. In der zweiten Variante waren die entsprechenden Indikatoren (174,4 + 42,8) ml und (8,8 + 3,4) x 10 ⁶ /ml; im dritten - (173,7 + 41,3) ml und (9,3 + 3,8) x 10 ⁶ /ml. Die häufigste Infektion von Nabelschnurblutproben wurde bei Verwendung eines offenen Systems beobachtet. Es wurde eine direkte Korrelation zwischen der Masse der Plazenta und dem entnommenen Blutvolumen festgestellt – mit zunehmender Masse der Plazenta steigt die entnommene Blutmenge.

Nach der Nabelschnurblutentnahme folgt der Trennungsschritt – Isolierung der mononukleären Zellen und Reinigung der Zellsuspension von Erythrozyten. Unter experimentellen Bedingungen werden kernhaltige Zellen durch Sedimentation mit Methylcellulose während der Lyse von Erythrozyten mit Ammoniumchlorid isoliert. Methylcellulose sollte jedoch nicht für klinische Zwecke verwendet werden, da die Verluste an hämatopoetischen Stammzellen dabei 50 – 90 % erreichen. Die Lyse von Erythrozyten wird in der Klinik aufgrund der großen Volumina der Arbeitslösung auch fast nie durchgeführt, obwohl der Prozentsatz der Isolierung kernhaltiger Zellen mit dem Phänotyp CD34+ sowie von Progenitorzellen mit den Funktionen CFU-GM und CFU-GEMM auf diese Weise deutlich höher ist. Es wird über die Entwicklung eines neuen Mittels zur Isolierung mononukleärer Zellen in einem Dichtegradienten, der Buyant Density Solution (BDS72), berichtet. Diese Substanz hat folgende physiologische Parameter: pH 7,4, Osmolalität 280 mOsm/kg, Dichte 1,0720 g/ml. Laut den Autoren können damit bis zu 100 % der CD34-positiven Zellen isoliert und 98 % der Erythrozyten entfernt werden. BDS72 wird jedoch noch nicht klinisch eingesetzt.

Bei den zugelassenen Methoden zur Isolierung kernhaltiger Zellen aus Nabelschnurblut werden üblicherweise eine 10%ige Hydroxyethylstärkelösung oder eine 3%ige Gelatinelösung verwendet. Die Effizienz der Sedimentation von Erythrozyten und der Isolierung kernhaltiger Zellen ist in beiden Fällen ungefähr gleich. Bei Verwendung von Gelatine als Sedimentationsmittel kann jedoch eine etwas größere Menge an CFU-GM erhalten werden als bei Verwendung von Hydroxyethylstärke. Es wird angenommen, dass die Unterschiede in der Effizienz der CFU-GM-Isolierung auf verschiedene Sedimentationsraten einzelner Fraktionen kernhaltiger Zellen oder auf die Fähigkeit von Hydroxyethylstärkemolekülen zurückzuführen sind, auf der Oberfläche hämatopoetischer Zellrezeptoren zu absorbieren und dadurch deren Empfindlichkeit gegenüber koloniestimulierenden Faktoren zu blockieren, die bei der Kultivierung von CFU-GM in vitro verwendet werden. Trotzdem können beide Sedimentatoren gut zur Isolierung kernhaltiger Zellen beim Aufbau großer Nabelschnurblutbanken geeignet sein.

Die Methoden der Nabelschnurblutseparation und Kryokonservierung unterscheiden sich grundsätzlich nicht von denen, die bei der Arbeit mit hämatopoetischen Stammzellen aus peripherem Blut und Knochenmark erwachsener Spender verwendet werden. Bei der Vorbereitung einer großen Anzahl von Nabelschnurblutproben für die Blutbanken müssen die Trennmethoden jedoch vor allem kostengünstig sein. Daher werden derzeit leider für klinische Zwecke bereits erprobte Routinemethoden zur Isolierung und Kryokonservierung von Nabelschnurblutzellen verwendet, und effektivere, aber kostspieligere Methoden bleiben den Experimentatoren vorbehalten.

Generell wurden Kriterien zur Bestimmung der Anzahl hämatopoetischer Zellen und Anforderungen für die Untersuchung von Nabelschnurblutproben zur Identifizierung von Infektionserregern genehmigt. Um die Sicherheit der Transplantation hämatopoetischer Zellen aus Nabelschnurblut zu gewährleisten, müssen alle Blutproben primär auf hämatogen übertragbare Infektionen und genetische Erkrankungen untersucht werden. Mehrere Autoren empfehlen zusätzliche spezielle Methoden zur Untersuchung von Nabelschnurblut zur Diagnose genetischer Erkrankungen wie α-Thalassämie, Sichelzellenanämie, Adenosindeaminasemangel, Bruton-Agammaglobulinämie, Morbus Hurler und Morbus Ponter.

Gemäß den Empfehlungen von L. Ticheli und Co-Autoren (1998) muss jede Nabelschnurblutprobe auf kernhaltige Zellen, CD34-positive Zellen und CFU-GM getestet, eine HLA-Typisierung durchgeführt und die Blutgruppe anhand von ABO und Rhesusfaktor bestimmt werden. Darüber hinaus sind eine bakteriologische Kultur, serologische Tests auf HIV- und Cytomegalievirus-Infektion, HBsAg, Virushepatitis C, HTLY-I und HTLV-II (humane T-Zell-Leukämie), Syphilis und Toxoplasmose erforderlich. Eine Polymerase-Kettenreaktion zur Erkennung einer Cytomegalievirus- und HIV-Infektion ist obligatorisch.

Das Verfahren zur Entnahme von Nabelschnurblut muss in strikter Übereinstimmung mit den Grundsätzen der medizinischen Bioethik durchgeführt werden. Vor der Blutentnahme ist das Einverständnis der schwangeren Frau einzuholen. Ein Vorgespräch mit der schwangeren Frau zur Einholung einer informierten Einwilligung für alle Vorgänge, von der Blutentnahme bis zum Ausfüllen der Unterlagen, wird nur von medizinischem Personal geführt. Aufgrund der Verletzung etablierter Normen der Bioethik und der Menschenrechte ist es in keinem Fall zulässig, dass diese Verfahren von Personal mit biologischer, chemischer, pharmazeutischer oder anderer nicht-medizinischer Ausbildung durchgeführt werden. Im Falle eines positiven Tests auf HBsAg-Belastung, des Vorhandenseins von Antikörpern gegen die Erreger von Hepatitis C, HIV-Infektion und Syphilis wird kein Nabelschnurblut entnommen, und Proben bereits entnommenen Blutes werden verworfen und vernichtet. Es ist zu beachten, dass Neugeborene weitaus seltener latente Infektionen aufweisen als Erwachsene. Daher ist die Wahrscheinlichkeit einer hämatogenen Übertragung und der Entwicklung infektiöser Komplikationen bei Infusionen hämatopoetischer Zellen aus Nabelschnurblut wesentlich geringer als bei der Verwendung von Knochenmark eines erwachsenen Spenders für die Transplantation.

Ein wichtiger Aspekt der klinischen Anwendung von Nabelschnurblut ist die Transplantationsbewertung. Diese basiert auf der Bestimmung der Menge an hämatopoetischen Stammzellen in einer Nabelschnurblutprobe und der für die Transplantation erforderlichen Zelldosen. Derzeit wurden noch keine Standards für die optimale Menge an Nabelschnurblutzellen entwickelt, die für eine Transplantation erforderlich sind. Selbst zu Routineparametern wie der Anzahl CD34-positiver Zellen und CFU-GM gibt es keine allgemein akzeptierte Meinung. Einige Autoren bewerten das Potenzial hämatopoetischer Zellen durch die Analyse von Langzeitkulturen mit Bestimmung des Gehalts an koloniebildenden Einheiten, die Granulozyten, Erythrozyten, Monozyten und Megakaryozyten gemeinsam sind - CFU-GEMM.

Im klinischen Umfeld umfasst die Standardbewertung einer Nabelschnurbluttransplantation jedoch typischerweise nur die Bestimmung der Anzahl kernhaltiger oder mononukleärer Zellen.

Lagerung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut

Es gibt auch einige Probleme bei der Technologie der Lagerung hämatopoetischer Zellen aus Nabelschnurblut. Bei der Kryokonservierung hämatopoetischer Stammzellen ist es, um ein optimales Gefrierverfahren zu erreichen, notwendig, das Volumen des Nabelschnurbluts so weit wie möglich zu reduzieren und auch vorab Erythrozyten zu entfernen, um Hämolyse und das Risiko einer Inkompatibilitätsreaktion für Erythrozytenantigene (ABO, Rh) zu vermeiden. Für diese Zwecke sind verschiedene Methoden zur Isolierung kernhaltiger Zellen geeignet. In den frühen 90er Jahren des letzten Jahrhunderts war die Isolierung kernhaltiger Zellen in einem Dichtegradienten auf Basis von Ficoll mit einer Dichte von 1,077 g/ml oder Percoll mit einer Dichte von 1,080 g/ml die am weitesten verbreitete Methode. Die Trennung von Nabelschnurblut in einem Dichtegradienten ermöglicht die Isolierung überwiegend mononukleärer Zellen, führt aber zu erheblichen Verlusten an hämatopoetischen Vorläuferzellen – bis zu 30-50 %.

Die Sedimentationseffizienz von Hydroxyethylstärke bei der Isolierung hämatopoetischer Zellen aus Nabelschnurblut wird unterschiedlich bewertet. Einige Autoren weisen auf die geringe Trennqualität dieser Methode hin, während andere Forscher im Gegensatz dazu die Isolierung von Nabelschnurblut-HSCs mit einer 6%igen Hydroxyethylstärkelösung unter allen möglichen Methoden bevorzugen. Gleichzeitig wird die hohe Effizienz der Sedimentation hämatopoetischer Zellen hervorgehoben, die einigen Daten zufolge zwischen 84 % und 90 % liegt.

Vertreter einer anderen Ansicht glauben, dass praktisch alle Fraktionierungsmethoden mit großen Verlusten kernhaltiger Zellen verbunden sind, und schlagen vor, die Trennung durch Zentrifugation vorzunehmen und das Nabelschnurblut in drei Fraktionen zu teilen: Erythrozyten, Leukozytenring und Plasma. Durch die Isolierung der Zellen auf diese Weise stellten die Autoren fest, dass der Gehalt an mononukleären Zellen, frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen und Zellen mit dem Immunphänotyp CD34+ schließlich 90, 88 bzw. 100 % des Ausgangswerts betrug. Ähnliche Werte für die Zunahme der mit dieser Methode gereinigten Nabelschnurblutzellen wurden auch von anderen Forschern erhalten: Nach der Sedimentation wurden 92 % kernhaltige Zellen, 98 % mononukleäre Zellen, 96 % CD34-positive Zellen und 106 % koloniebildende Einheiten isoliert.

In den späten 1990er Jahren wurde Gelatine häufig als Sedimentationsmittel verwendet. In der klinischen Praxis wird Gelatine seit 1994 zur Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut eingesetzt. Bei Verwendung einer 3%igen Gelatinelösung erreicht die Effizienz der Isolierung kernhaltiger Zellen 88–94 %. Der großflächige Einsatz von Gelatine beim Aufbau einer Nabelschnurblutbank hat ihre Vorteile gegenüber anderen Sedimentationsmittel bestätigt. Eine vergleichende Analyse der Effizienz aller oben genannten Methoden zur Isolierung kernhaltiger Zellen unter den Bedingungen ihrer sequenziellen Anwendung an jeder der getesteten Nabelschnurblutproben hat gezeigt, dass eine 3%ige Gelatinelösung das optimale Sedimentationsmittel hinsichtlich der Ausbeute an mononukleären Zellen mit dem Phänotyp CD34+/CD45+ sowie hinsichtlich der Anzahl von CFU-GM und CFU-GEMM ist. Methoden mit einem Ficoll-Dichtegradienten sowie die Verwendung von Hydroxyethylstärke und Methylcellulose waren deutlich weniger effektiv, wobei die Verluste an hämatopoetischen Zellen bis zu 60 % erreichten.

Die Ausweitung des Volumens von Nabelschnurblutstammzelltransplantationen ist nicht nur mit der Entwicklung von Methoden zu ihrer Gewinnung, sondern auch ihrer Lagerung verbunden. Es gibt viele Probleme, die direkt mit der Vorbereitung des Nabelschnurbluts für die Langzeitlagerung und der Wahl der optimalen Technologie für die Kryokonservierung der Proben zusammenhängen. Dazu gehören die Fragen der Durchführbarkeit von Trennungsverfahren, der Verwendung verschiedener Kryokonservierungsmedien und der Anwendung von Methoden zur Vorbereitung aufgetauter Zellen für die Transplantation. Der Transport nativer Nabelschnurblutproben erfolgt häufig aus Regionen, die weit von hämatologischen Zentren entfernt sind. In diesem Zusammenhang stellt sich das Problem akzeptabler Lagerzeiträume für Nabelschnurblut vom Zeitpunkt der Gewinnung bis zum Beginn der Kryokonservierung, was bei der Einrichtung von Nabelschnurblutbanken von besonderer Bedeutung ist.

Eine Studie zur funktionellen Aktivität hämatopoetischer Zellen in Nabelschnurblut nach Langzeitlagerung (bis zu 12 Jahren) in flüssigem Stickstoff hat gezeigt, dass etwa 95 % der hämatopoetischen Zellen während dieses Zeitraums ihre hohe proliferative Kapazität nicht verlieren. In der Arbeit von S. Yurasov und Co-Autoren (1997) wurde nachgewiesen, dass die Lagerung von Nabelschnurblut bei Raumtemperatur (22°C) oder bei 4°C für 24 und 48 Stunden die Lebensfähigkeit der hämatopoetischen Zellen nicht signifikant reduziert, die 92 bzw. 88 % des Ausgangsniveaus beträgt. Wird die Lagerdauer jedoch auf drei Tage verlängert, nimmt die Anzahl lebensfähiger kernhaltiger Zellen im Nabelschnurblut signifikant ab. Gleichzeitig haben andere Studien gezeigt, dass bei einer Lagerung für 2 – 3 Tage bei 22 oder 4°C in erster Linie die Lebensfähigkeit reifer Granulozyten und nicht die der hämatopoetischen Zellen leidet.

Die Lebensfähigkeit hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut kann durch Komponenten von Nabelschnurblutentnahmesystemen negativ beeinflusst werden. Eine Analyse der Wirkung verschiedener Antikoagulanzien, deren Wirkmechanismus auf der Bindung von Calciumionen (ACD, EDTA, XAPD-1) beruht, auf hämatopoetische Vorläuferzellen unter Bedingungen einer Nabelschnurblutlagerung für 24 bis 72 Stunden ergab deren negative Wirkung auf die Lebensfähigkeit kernhaltiger Zellen. In diesem Zusammenhang empfehlen die Autoren die Verwendung von PBS (Phosphatpufferlösung) mit Zusatz von nativem Heparin ohne Konservierungsmittel in einer Konzentration von 20 U/ml, wodurch ihrer Meinung nach die Lagerdauer von unfraktioniertem Nabelschnurblut auf 72 Stunden verlängert und die funktionelle Aktivität koloniebildender Einheiten erhalten bleibt. Eine Studie zur Sicherheit von CFU-GM und CFU-G zeigte jedoch, dass die Lagerzeit von Nabelschnurblut vor der Kryokonservierung neun Stunden nicht überschreiten sollte. Offensichtlich sollte in diesem Fall der Grundsatz gelten, dass bei Vorliegen widersprüchlicher Daten die empfohlene Mindestlagerzeit für Nabelschnurblut eingehalten und das programmierte Einfrieren der isolierten Zellen so schnell wie möglich eingeleitet werden sollte.

Beim Einfrieren hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut wird üblicherweise eine 10%ige DMSO-Lösung als Kryoprotektivum verwendet. Neben der ausgeprägten kryoprotektiven Wirkung hat Dimethylsulfoxid in dieser Konzentration jedoch auch eine direkte zytotoxische Wirkung, selbst bei minimaler Exposition gegenüber hämatopoetischen Zellen aus Nabelschnurblut. Um die zytotoxische Wirkung von DMSO zu reduzieren, wird eine Null-Expositionstemperatur verwendet, die Geschwindigkeit aller Manipulationen erhöht und nach dem Auftauen der Nabelschnurblutproben mehrere Waschvorgänge durchgeführt.

Seit 1995 entwickelt das Institut für Hämatologie und Transfusiologie der Akademie der Medizinischen Wissenschaften der Ukraine eine wissenschaftliche Ausrichtung, die auf eine umfassende Untersuchung von Nabelschnurblut als alternative Quelle hämatopoetischer Stammzellen abzielt. Insbesondere wurden neue Technologien für die Niedertemperatur-Kryokonservierung hämatopoetischer Zellen aus unfraktioniertem und fraktioniertem Nabelschnurblut entwickelt. Als Kryoprotektivum wird niedermolekulares medizinisches Polyvinylpyrrolidon verwendet. Die Methode der Kryokonservierung von unfraktioniertem Nabelschnurblut basiert auf einer originellen Technologie zur Vorpräparation von Zellen für das Einfrieren und einer Methode zur speziellen Verarbeitung der Zellsuspension unmittelbar vor der Transplantation.

Einer der wichtigsten Faktoren, der die funktionelle Aktivität kryokonservierter hämatopoetischer Stammzellen beeinflusst, ist die Abkühlungsgeschwindigkeit der Zellsuspension, insbesondere während der Kristallisationsphase. Ein Softwareansatz zur Lösung des Problems von Gefriergeschwindigkeit und -zeit bietet hervorragende Möglichkeiten für die Entwicklung einfacher und hochwirksamer Kryokonservierungsmethoden, ohne dass die Zellsuspension vor der Transplantation von Kryoprotektoren gereinigt werden muss.

Die gefährlichsten Phasen für die Lebensfähigkeit von Zellen während ihrer Herstellung sind das direkte Einfrieren und Auftauen. Beim Einfrieren hämatopoetischer Zellen kann ein erheblicher Teil davon beim Übergang des interzellulären Mediums von der flüssigen in die feste Phase – der Kristallisation – zerstört werden. Um den Zelltod zu reduzieren, werden Kryoprotektoren eingesetzt, deren Wirkmechanismen und kryoprotektive Wirksamkeit in der wissenschaftlichen Literatur ausreichend beschrieben sind.

Eine vielversprechende Richtung zur Optimierung von Kryokonservierungsmethoden für Knochenmark- und Nabelschnurblutzellen ist die Kombination niedriger Konzentrationen mehrerer Kryoprotektoren mit unterschiedlichen Wirkmechanismen in einer Lösung, beispielsweise DMSO, das auf intrazellulärer Ebene wirkt, und Hydroxyethylstärke oder Albumin, die eine extrazelluläre Schutzwirkung haben.

Zur Kryokonservierung von Nabelschnurblutzellen wird traditionell eine 20%ige DMSO-Lösung verwendet, die unter ständigem mechanischem Rühren in einem Eisbad langsam in die Zellsuspension gegossen wird, bis ein gleiches Verhältnis (1:1) zwischen den Volumina von Kryoprotektivum und Zellsuspension erreicht ist. Die Endkonzentration von Dimethylsulfoxid beträgt 10 %. Die Zellsuspension wird dann in einer programmierten Kryoeinheit mit einer Rate von GS/min auf -40 °C abgekühlt, wonach die Abkühlrate auf 10 °C/min erhöht wird. Nach Erreichen von -100 °C wird der Behälter mit der Zellsuspension in flüssigen Stickstoff (-196 °C) gestellt. Mit dieser Kryokonservierungstechnik erreicht die Konservierung funktionell aktiver mononukleärer Zellen nach dem Auftauen 85 % des ursprünglichen Niveaus.

Modifikationen der Kryokonservierungsmethoden zielen darauf ab, die DMSO-Konzentration durch Zugabe von Hydroxyethylstärke zu reduzieren (die Endkonzentrationen von Dimethylsulfoxid und Hydroxyethylstärke betragen 5 bzw. 6 %). Eine hohe Effizienz einer solchen Kombination von Kryoprotektoren wird beim Einfrieren einer Suspension myeloider Zellen beobachtet, und zwar mit nicht geringerer Zytoprotektion als bei Verwendung einer alleinigen 10%igen Dimethylsulfoxidlösung. Die Anzahl lebensfähiger kernhaltiger Zellen erreichte 96,7 % des Ausgangsniveaus, und ihre funktionelle Aktivität, geschätzt anhand der Anzahl der CFU-GM, betrug 81,8 %.

Bei Verwendung einer Dimethylsulfoxidlösung in Konzentrationen von 5 bis 10 % in Kombination mit 4 % Hydroxyethylstärke (Endkonzentration) wurde festgestellt, dass die Sicherheit CD34-positiver Zellen in solchen Dimethylsulfoxidbereichen praktisch unverändert bleibt. Gleichzeitig wird bei einer Verringerung der Dimethylsulfoxidkonzentration von 5 auf 2,5 % ein Massensterben von Nabelschnurblutzellen beobachtet – die Zahl der lebensfähigen Zelleinheiten sinkt von 85,4 auf 12,2 %. Auch andere Autoren kamen zu dem Schluss, dass es 5- und 10-prozentige Dimethylsulfoxidlösungen (in der Version des Autors – in Kombination mit autologem Serum) sind, die bei der Kryokonservierung von Nabelschnurblut-HSCs einen maximal wirksamen Zytoprotektion bieten. Darüber hinaus wurde bei einer Kombination aus 5 oder 10 % Dimethylsulfoxid mit einer 4 % Hydroxyethylstärkelösung eine hohe Konservierung von sukzessive gefrorenen und aufgetauten Zellen festgestellt, insbesondere bei einer kontrollierten Abkühlrate von GS/min. In einer anderen Studie wurde eine Kryoprotektivlösung verwendet, die aus drei Bestandteilen bestand – DMSO, gereinigtes Humanalbumin und RPMI-Medium im Verhältnis 1:4:5 –, die der Zellsuspension im gleichen Volumenverhältnis zugesetzt wurde (die Endkonzentration von Dimethylsulfoxid betrug 5 %). Nach dem Auftauen in einem Wasserbad bei einer Temperatur von +4 GS lag die Konservierung von CFU-GM bei über 94 %.

Einige Autoren schlagen vor, unfraktioniertes Nabelschnurblut zur Kryokonservierung zu verwenden, da bei der Entnahme roter Blutkörperchen erhebliche Mengen hämatopoetischer Zellen verloren gehen. Bei dieser Variante wird eine 10%ige Dimethylsulfoxidlösung verwendet, um mononukleäre Zellen vor den schädlichen Auswirkungen der Kryokristallisation zu schützen. Das Einfrieren erfolgt mit einer konstanten Abkühlrate von GS/min auf -80 °C, anschließend wird die Nabelschnurblutzellsuspension in flüssigen Stickstoff getaucht. Bei dieser Gefriermethode kommt es zu einer teilweisen Lyse der roten Blutkörperchen, sodass die Blutproben nicht fraktioniert werden müssen. Nach dem Auftauen wird die Zellsuspension in einer Lösung aus menschlichem Albumin oder im autologen Blutserum des Patienten von freiem Hämoglobin und Dimethylsulfoxid gereinigt und für die Transplantation verwendet.

Die Konservierung hämatopoetischer Vorläuferzellen nach dem Auftauen von unfraktioniertem Nabelschnurblut ist zwar höher als die von fraktioniertem Nabelschnurblut, jedoch können aufgrund der Kryostabilität einiger Erythrozyten schwerwiegende posttransfusionelle Probleme durch die Transfusion ABO-inkompatibler Erythrozyten auftreten. Zudem erhöht sich das Volumen des gelagerten unfraktionierten Blutes deutlich. Aus klinischer Sicht ist die Kryokonservierung zuvor isolierter und von anderen Zellfraktionen gereinigter hämatopoetischer Zellen aus Nabelschnurblut weiterhin vorzuziehen.

Insbesondere wurde ein Verfahren zur Kryokonservierung fraktionierter Nabelschnurblutzellen entwickelt, das die Entnahme von Erythrozyten bereits bei der Vorbereitung zum Einfrieren ermöglicht. Dabei wird eine 6%ige Hydroxyethylstärkelösung als Bestandteil der Plasmaersatzlösung „Stabizol“ verwendet. Nach dem Auftauen ist die so gewonnene Zellsuspension ohne weitere Manipulationen für den klinischen Einsatz bereit.

Derzeit gibt es viele recht wirksame Methoden zur Kryokonservierung von Nabelschnurblut. Ihr grundlegender Unterschied besteht darin, dass die Blutproben entweder unfraktioniert eingefroren werden oder in der Vorbereitungsphase einer Trennung in Zellfraktionen unterzogen werden und kernhaltige Zellen ohne Beimischung von Erythrozyten hergestellt werden.

Transplantation hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut

In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren wurde festgestellt, dass Nabelschnurblut, das dem Fötus während der Schwangerschaft lebenserhaltende Maßnahmen bietet, einen hohen Gehalt an hämatopoetischen Stammzellen aufweist. Die relativ einfache Gewinnung von Nabelschnurblutzellen und das Fehlen offensichtlicher ethischer Probleme trugen zur Verwendung von Nabelschnurblutstammzellen in der praktischen Medizin bei. Die erste erfolgreiche Nabelschnurbluttransplantation bei einem Kind mit Fanconi-Anämie diente als Ausgangspunkt für die Ausweitung der Nabelschnurblutstammzelltransplantationen und die Schaffung eines Systems für deren Lagerung. Die größte der weltweiten Nabelschnurblutbanken ist das New York Placental Blood Center, das in der Bilanz des US-amerikanischen National Institute of Health geführt wird. Die Zahl der in dieser Bank gelagerten Nabelschnurblutproben nähert sich 20.000. Auch die Zahl der Empfänger (meist Kinder), die eine erfolgreiche Transplantation erhalten haben, wächst. Nach Angaben des US-Gesundheitsministeriums beträgt die rezidivfreie Lebenszeit von Nabelschnurblutempfängern nach einer Transplantation bereits mehr als 10 Jahre.

Dies ist nicht überraschend, da zahlreiche Studien zum hämatopoetischen Potenzial von Nabelschnurblut gezeigt haben, dass es hinsichtlich der Quantität und Qualität der frühesten Stammzellen dem Knochenmark eines Erwachsenen nicht nur nicht unterlegen ist, sondern es in einigen Punkten sogar übertrifft. Das höhere proliferative Potenzial von Nabelschnurblutstammzellen ist auf die ontogenetischen Merkmale der zellulären Signalübertragung, das Vorhandensein von Rezeptoren für spezifische Wachstumsfaktoren auf den HSC, die Fähigkeit von Nabelschnurblutzellen zur autokrinen Produktion von Wachstumsfaktoren sowie die Größe und Länge der Telomere zurückzuführen.

Somit sind die genomischen und phänotypischen Eigenschaften der hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut eine Voraussetzung für eine qualitativ hochwertige Transplantation des Transplantats mit einem hohen Potenzial für die Wiederherstellung der Spenderhämatopoese im Körper des Empfängers.

Vorteile von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut

Zu den echten Vorteilen der Verwendung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut für Transplantationen gegenüber anderen Quellen hämatopoetischer Zellen zählen das praktisch nicht vorhandene Risiko für die Gesundheit des Spenders (sofern wir die Plazenta nicht als solche betrachten) und das Fehlen einer Vollnarkose. Die Verwendung von Nabelschnurblut erweitert die Möglichkeiten der Zelltransplantation aufgrund teilweise HLA-kompatibler Transplantate (Inkompatibilität von einem bis drei Antigenen). Es wurde eine Methode zur langfristigen Lagerung hämatopoetischer Zellen aus Nabelschnurblut in gefrorenem Zustand entwickelt, die die Wahrscheinlichkeit erhöht, seltene HLA-Typen zu erhalten und die Zeit für die Suche nach einem HLA-kompatiblen Transplantat für eine allogene Transplantation verkürzt. Gleichzeitig wird das Risiko, bestimmte latente, durch übertragbare Mittel übertragene Infektionen zu entwickeln, erheblich reduziert. Darüber hinaus entsteht durch die Möglichkeit, Nabelschnurblutzellen für autologe Transplantationen zu verwenden, eine kostengünstige Form der biologischen Lebensversicherung.

Aufgrund der geringen Blutmengen, die aus der Plazenta gewonnen werden können (im Durchschnitt nicht mehr als 100 ml), stellt sich jedoch das Problem, die größtmögliche Menge Blut aus der Nabelschnurvene zu gewinnen und dabei streng die Bedingung eines minimalen Risikos einer bakteriellen Kontamination der gewonnenen Nabelschnurblutproben einzuhalten.

Primitive hämatopoetische Zellen aus Nabelschnurblut werden normalerweise durch das Vorhandensein des Glykophosphoproteins CD34 auf ihrer Oberfläche sowie anhand ihrer funktionellen Eigenschaften durch Untersuchung der Klonogenität oder Koloniebildung in vitro identifiziert. Vergleichende Analysen haben gezeigt, dass in Nabelschnurblut und Knochenmark der maximale Gehalt an CD34-positiven Zellen in der mononukleären Fraktion 1,6 bzw. 5,0 % beträgt, der maximale Grad an koloniebildenden Einheiten in der CD34+-Zellsubpopulation 80 bzw. 25 %, die Gesamtklonierungseffizienz von CD34+-Zellen 88 bzw. 58 % und der maximale Gehalt an koloniebildenden Zellen mit hohem Proliferationspotenzial (HPP-CFC in der CD34+-Population) 50 bzw. 6,5 % beträgt. Es sollte hinzugefügt werden, dass die Effizienz des Klonens von CD34+CD38-Zellen und die Fähigkeit, auf Zytokinstimulation zu reagieren, in hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut ebenfalls höher sind.

Die Kombination der phänotypischen Antigene Thy-1, CD34 und CD45RA bestätigt das hohe proliferative Potenzial der hämatopoetischen Zellen des Nabelschnurbluts, und die Expression dieser drei Antigene auf der Oberfläche der Nabelschnurblutzellen weist auf ihre Zugehörigkeit zu den Stammzellen hin. Außerdem wurde festgestellt, dass Nabelschnurblut Zellen mit dem Phänotyp CD34+ enthält, die keine Marker für lineare Differenzierung aufweisen. Der Anteil der Zellsubpopulationen mit dem phänotypischen Profil CD34+/Lin im Nabelschnurblut beträgt etwa 1 % der Gesamtzahl der CD34-positiven Zellen. Aus den hämatopoetischen Vorläuferzellen des Nabelschnurbluts entstehen sowohl die lymphatische Zelllinie als auch die pluripotente myeloide Zellreihe mit linearer Zelldifferenzierung, was ebenfalls auf ihre Zugehörigkeit zu den Stammzellen hinweist.

Wie bereits erwähnt, bestehen erhebliche Unterschiede zwischen Knochenmark und Nabelschnurblut in der Menge der für die Transplantation verwendeten hämatopoetischen Zellen, die während eines Entnahmevorgangs gewonnen werden. Während bei einer Knochenmarktransplantation der Verlust an Zellmasse während der Trennung, Kryokonservierung, des Auftauens und der Untersuchung innerhalb von 40–50 % akzeptabel ist, sind solche Zellverluste bei Nabelschnurblut sehr signifikant, da sich die Transplantation bei Verwendung einer unzureichenden Menge an HSC als unwirksam erweisen kann. Laut G. Kogler et al. (1998) können bei einer Zelltransplantation mit einem Körpergewicht des Empfängers von 10 kg alle Nabelschnurblutproben potenzielle Transplantate sein (die Gesamtzahl der gesammelten Nabelschnurblutproben beträgt 2098), bei einem Körpergewicht von 35 kg - 67 %, und nur 25 % der Proben können bei Patienten mit einem Körpergewicht von 50–70 kg eine wirksame Transplantation ermöglichen. Diese klinische Situation zeigt die Notwendigkeit, die Effizienz bestehender Methoden zur Entnahme, Reproduktion und Lagerung von Nabelschnurblutzellen zu optimieren und zu verbessern. Daher werden in der Literatur derzeit ausführlich die Fragen der Standardisierung von Methoden zur Entnahme, Untersuchung, Trennung und Kryokonservierung von Nabelschnurblut zur Einrichtung von Blutbanken sowie seiner Verwendung in der Klinik diskutiert und auch die Bedingungen und Fristen für die Lagerung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut festgelegt.

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Verwendung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut in der Medizin

^{Normalerweise können bis zu 10 6} hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut isoliert werden, selten mehr. In dieser Hinsicht ist die Frage, ob eine solche Menge hämatopoetischer Zellen aus Nabelschnurblut ausreicht, um die Hämatopoese bei einem erwachsenen Empfänger wiederherzustellen, bis heute offen. Die Meinungen zu diesem Thema sind geteilt. Einige Forscher glauben, dass eine solche Menge für eine Transplantation bei Kindern völlig ausreichend ist, aber zu wenig für eine Transplantation bei Erwachsenen, für die die optimale Menge die Einführung von (7-10) x 10 ⁶ CD34-positiven Zellen pro 1 kg Körpergewicht ist - durchschnittlich 7 x 10 ⁸ pro Transplantation. Aus diesen Berechnungen folgt, dass eine Probe Nabelschnurblut 700-mal weniger hämatopoetische Stammzellen enthält, als für eine Transplantation bei einem erwachsenen Patienten erforderlich sind. Eine solche quantitative Bewertung erfolgt jedoch analog zur Anzahl der transfundierten Knochenmarkszellen und berücksichtigt die ontogenetischen Merkmale der Hämatopoese überhaupt nicht.

Insbesondere wird die Tatsache ignoriert, dass hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut ein höheres proliferatives Potenzial haben als hämatopoetische Vorläuferzellen aus Knochenmark. Die Ergebnisse von In-vitro-Studien zum Koloniebildungspotenzial legen nahe, dass eine Dosis Nabelschnurblut die Hämatopoese eines erwachsenen Empfängers wiederherstellen kann. Andererseits darf nicht vergessen werden, dass die Zahl der Nabelschnurblut-Stammzellen sogar während der Embryonalentwicklung abnimmt: Der Gehalt an CD34-positiven Zellen im Nabelschnurblut nimmt im Zeitraum von der 20. Woche (das Blut für die Studie wurde während eines vorzeitigen Schwangerschaftsabbruchs gewonnen) bis zur 40. Schwangerschaftswoche (der Zeit der physiologischen Wehen) linear um das Fünffache ab, was mit einer parallel dazu permanent zunehmenden Expression linearer Zytodifferenzierungsmarker einhergeht.

Aufgrund des Fehlens eines standardisierten Ansatzes zur quantitativen Bestimmung von Progenitorzellen in Nabelschnurblutproben wird weiterhin über die optimale Dosis hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut diskutiert. Einige Forscher glauben, dass die Anzahl der kernhaltigen und mononukleären Zellen, neu berechnet auf das Körpergewicht des Empfängers, d. h. ihre Dosis, als Kriterium für die Auswahl der Nabelschnurblutproben verwendet werden kann. Einige Autoren glauben, dass der minimale quantitative Schwellenwert für CD34+-Zellen selbst bei der Autotransplantation von HSCs 2 x 10 ⁶ /kg beträgt. Gleichzeitig gewährleistet eine Erhöhung der Dosis hämatopoetischer Zellen auf 5 x 10 ⁶ Zellen/kg (nur 2,5-mal) bereits einen günstigeren Verlauf in der frühen Zeit nach der Transplantation, verringert die Häufigkeit infektiöser Komplikationen und verkürzt die Dauer der vorbeugenden Antibiotikatherapie.

Laut E. Gluckman et al. (1998) ist in der Onkohämatologie die Voraussetzung für eine erfolgreiche Nabelschnurblutzelltransplantation die Einführung von mindestens 3,7 x 10 ⁷ kernhaltigen Zellen pro 1 kg Körpergewicht des Empfängers. Wenn die Dosis hämatopoetischer Stammzellen auf 1 x 10 ⁷ oder weniger kernhaltige Zellen pro 1 kg Körpergewicht des Patienten reduziert wird, steigt das Risiko eines Transplantatversagens und eines Rückfalls von Blutkrebs stark an. Es sollte beachtet werden, dass die Mindestzahl von Vorläuferzellen, die für eine schnelle Wiederherstellung der Hämatopoese nach Allotransplantation von HSCs erforderlich ist, noch unbekannt ist. Theoretisch kann dies mit einer Zelle erreicht werden, aber in der klinischen Praxis der Knochenmarktransplantation wird eine schnelle und stabile Transplantation durch die Transfusion von mindestens (1-3) x 10 ⁸ kernhaltigen Zellen pro 1 kg Körpergewicht des Patienten gewährleistet.

In einer kürzlich durchgeführten detaillierten Studie zur Bestimmung der optimalen HSZ-Zahl in der Onkohämatologie wurden Patienten in drei Gruppen beobachtet, die je nach Gehalt an CD34-positiven Zellen im transplantierten Material eingeteilt wurden. Patienten der ersten Gruppe wurden (3–5) x 106 Zellen/kg verabreicht ^.Die HSZ-Dosis bei Patienten der zweiten Gruppe betrug (5–10) x 106 Zellen/kg, und Patienten der dritten Gruppe wurden mehr als 10 x 106 CD34+-Zellen/kg transplantiert ^. Die besten Ergebnisse wurden in der Gruppe der Empfänger beobachtet, die ein Transplantat mit einer Anzahl CD34-positiver Zellen von (3–5) x 106/kg erhielten ^. Bei einer Erhöhung der Dosis der transplantierten Zellen über 5 x 106 ^/ kg zeigten sich keine statistisch signifikanten Vorteile. In diesem Fall ist ein sehr hoher Gehalt an HSCs im Transplantat (> 10 x 10 ⁶ /kg) mit der Reinfusion einer signifikanten Anzahl von residualen Tumorzellen verbunden, was zu einem Rückfall der Erkrankung führt. Ein direkter Zusammenhang zwischen der Anzahl der transplantierten allogenen Progenitorzellen und der Entwicklung der Graft-versus-Host-Reaktion konnte nicht nachgewiesen werden.

Die weltweit gesammelten Erfahrungen mit Nabelschnurbluttransplantationen bestätigen deren hohes Repopulationspotenzial. Die Anwachsrate des Nabelschnurbluttransplantats korreliert mit der Anzahl der eingeführten kernhaltigen Zellen. Die besten Ergebnisse werden bei einer Transplantation von 3 x 107 ^/ kg beobachtet, während diese Dosis bei Knochenmark 2 x 108/kg beträgt ^. Nach Angaben der Koordinierungszentren wurden Ende 2000 weltweit 1200 Nabelschnurblutzelltransplantationen durchgeführt, hauptsächlich von verwandten Spendern (83 %). Es liegt auf der Hand, dass Nabelschnurblut als Alternative zu Knochenmark für die Transplantation bei Patienten mit Hämoblastose in Betracht gezogen werden sollte.

Gleichzeitig gibt die neonatale Natur der Nabelschnurblutquelle aufgrund der funktionellen Eigenschaften der HSC Anlass zu Optimismus. Allerdings kann nur die klinische Erfahrung die Frage beantworten, ob eine einzige Nabelschnurblutprobe ausreicht, um die Hämatopoese bei einem erwachsenen Empfänger mit hämatopoetischer Aplasie wiederherzustellen. Die Transplantation von Nabelschnurblutzellen wird in Behandlungsprogrammen für viele Tumor- und Nicht-Tumorerkrankungen eingesetzt: Leukämie und myelodysplastische Syndrome, Non-Hodgkin-Lymphom und Neuroblastom, aplastische Anämie, kongenitale Fanconi- und Diamond-Blackfan-Anämie, Leukozytenadhäsionsdefizienz, Barr-Syndrom, Morbus Gunther, Hurler-Syndrom, Thalassämie.

Immunologische Aspekte der Transplantation hämatopoetischer Zellen aus Nabelschnurblut verdienen besondere Aufmerksamkeit und eine gesonderte Untersuchung. Es hat sich gezeigt, dass bei der Transplantation von Nabelschnurblutstammzellen von Spendern mit unvollständiger HLA-Kompatibilität die Transplantationsergebnisse durchaus zufriedenstellend sind, was laut den Autoren auf eine geringere Immunreaktivität von Nabelschnurblutzellen als von Knochenmark hindeutet.

Eine detaillierte Untersuchung der Zellzusammensetzung von Nabelschnurblut enthüllte Merkmale sowohl des phänotypischen Spektrums von Effektorzellen des Immunsystems als auch ihrer funktionellen Aktivität, sodass Nabelschnurblut als eine Quelle von HSZ mit einem relativ geringen Risiko für die Entwicklung einer „Graft-versus-Host“-Reaktion in Betracht gezogen werden kann. Zu den Anzeichen einer funktionellen Unreife immunkompetenter Zellen im Nabelschnurblut zählen das Ungleichgewicht bei der Zytokinproduktion und eine verminderte Sensibilität gegenüber der Zytokinregulierung der Immunantwort. Die daraus resultierende Hemmung der Aktivität zytotoxischer Lymphozyten gilt als ein Faktor, der zur Ausbildung einer immunologischen Toleranz gegenüber dem transplantierten hämatopoetischen Gewebe beiträgt. In der Population der Nabelschnurblut-Lymphozyten überwiegen im Gegensatz zum peripheren Blut und Knochenmark erwachsener Spender inaktive, unreife Lymphozyten und Suppressorzellen. Dies weist auf eine verminderte Bereitschaft der T-Lymphozyten des Nabelschnurbluts für eine Immunantwort hin. Ein wichtiges Merkmal der monozytären Population von Nabelschnurblutzellen ist der geringe Gehalt an funktionell vollwertigen und aktiven Antigen-präsentierenden Zellen.

Einerseits erweitert die geringe Reife der Effektorzellen des Immunsystems im Nabelschnurblut die Indikationen für seinen Einsatz in der Klinik, da diese Eigenschaften zu einer Verringerung der Intensität des Immunkonflikts zwischen den Zellen des Spenders und des Empfängers führen. Andererseits ist aber auch bekannt, dass ein Zusammenhang zwischen dem Entwicklungsgrad der „Graft-versus-Host“-Reaktion und der Antitumorwirkung der Transplantation, d. h. der Entwicklung des „Graft-versus-Leukämie“-Effekts, besteht. In diesem Zusammenhang wurde eine Studie zur Antitumor-Zytotoxizität von Nabelschnurblutzellen durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass trotz der tatsächlich abgeschwächten Reaktion immunkompetenter Nabelschnurblutzellen auf Antigenstimulation die primär aktivierten Lymphozyten natürliche Killerzellen und killerähnliche Zellen sind, die aktiv an den Mechanismen der Umsetzung der Antitumor-Zytotoxizität beteiligt sind. Darüber hinaus wurden im Nabelschnurblut Subpopulationen von Lymphozyten mit den Phänotypen CD16+CD56+ und CD16"TCRa/p+ gefunden. Es wird angenommen, dass diese Zellen in ihrer aktivierten Form die „Graft-versus-Leukemia“-Reaktion durchführen.

Am Institut für Onkologie der Akademie der Medizinischen Wissenschaften der Ukraine wurden Krebspatienten mit anhaltender hämatopoetischer Hypoplasie infolge von Chemo- und Strahlentherapie kryokonservierte hämatopoetische Zellen aus Nabelschnurblut verabreicht. Bei diesen Patienten konnte die gehemmte Hämatopoese durch die Transplantation hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut recht wirksam wiederhergestellt werden, was durch einen anhaltenden Anstieg des Gehalts an reifen geformten Elementen im peripheren Blut sowie durch eine Zunahme der Indikatoren, die den Zustand der zellulären und humoralen Immunität charakterisieren, belegt wurde. Die Stabilität des Repopulationseffekts nach der Transplantation hämatopoetischer Zellen aus Nabelschnurblut ermöglicht die Fortsetzung der Strahlen- und Chemotherapie ohne Unterbrechung der Behandlung. Es gibt Informationen über eine höhere Effizienz der Allotransplantation von Nabelschnurblutstammzellen bei onkohämatologischen Patienten: Das jährliche Rückfallrisiko einer Tumorerkrankung bei ihrer Verwendung betrug 25 % gegenüber 40 % bei Patienten mit transplantiertem allogenen Knochenmark.

Der Wirkungsmechanismus kryokonservierter Nabelschnurblutstammzellen ist als Ergebnis einer humoralen Stimulation der Hämatopoese des Empfängers zu betrachten. Diese Stimulation wird durch die einzigartige Fähigkeit neonataler Zellen zur autokrinen Produktion hämatopoetischer Wachstumsfaktoren verursacht und ist auch eine Folge der vorübergehenden Transplantation von Spenderzellen (belegt durch einen signifikanten Anstieg des fetalen Hämoglobingehalts im peripheren Blut der Empfänger am 7.-15. Tag nach der Transfusion im Vergleich zu den Ausgangsdaten). Das Fehlen von Posttransfusionsreaktionen bei Nabelschnurblutempfängern ist das Ergebnis der relativen Toleranz seiner immunkompetenten Zellen und ein Vertrauenskriterium für die biologische Eignung des kryokonservierten Materials.

T-Lymphozyten-Killer-Progenitorzellen aus Nabelschnurblut können unter dem Einfluss exogener Zytokinstimulation aktiviert werden. Dies dient der Entwicklung neuer Ex-vivo- und In-vivo-Methoden zur Induktion der Antitumor-Zytotoxizität transplantierter lymphatischer Elemente für eine anschließende Immuntherapie. Darüber hinaus ermöglicht die „Unreife“ des Genoms immunkompetenter Zellen aus Nabelschnurblut deren Nutzung zur Steigerung der Antitumoraktivität mithilfe molekularer Modellierungsmethoden.

Nabelschnurblut findet heute breite Anwendung, vor allem in der pädiatrischen Hämatologie. Bei Kindern mit akuter Leukämie reduziert die Allotransplantation von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut im Vergleich zur Allotransplantation von Knochenmark die Inzidenz der Graft-versus-Host-Krankheit signifikant. Dies geht jedoch mit einer längeren Periode von Neutro- und Thrombozytopenie und leider einer höheren Sterblichkeitsrate 100 Tage nach der Transplantation einher. Eine längere Erholungsphase der Granulozyten- und Thrombozytenwerte im peripheren Blut kann auf eine unzureichende Differenzierung einzelner Subpopulationen CD34-positiver Nabelschnurblutzellen zurückzuführen sein, was durch die geringe Absorption von radioaktivem Rhodamin und die geringe Expression von CD38-Antigenen auf ihrer Oberfläche belegt wird.

Gleichzeitig zeigte die Transplantation hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut bei erwachsenen Patienten, die aufgrund des Fehlens eines kompatiblen, nicht verwandten Knochenmarkspenders und der Möglichkeit zur Mobilisierung autologer Stammzellen durchgeführt wurde, ein hohes einjähriges rezidivfreies Überleben in der Gruppe der Patienten unter 30 Jahren (73 %). Die Erweiterung der Altersspanne der Empfänger (18–46 Jahre) führte zu einer Verringerung des Überlebens auf 53 %.

Die quantitative Analyse von Zellen mit dem Phänotyp CD34+ in Knochenmark und Nabelschnurblut ergab ihren höheren (3,5-fachen) Gehalt im Knochenmark, aber ein signifikantes Überwiegen von Zellen mit dem phänotypischen Profil CD34+HLA-DR wurde im Nabelschnurblut festgestellt. Es ist bekannt, dass Blutzellen mit den immunologischen Markern CD34+HLA-DR aktiver proliferieren als Zellen mit dem Immunphänotyp CD34+HLA-DR+, was in experimentellen Studien zum Wachstum von Langzeitkulturen hämatopoetischer Zellen in vitro bestätigt wurde. Primitive Zellvorläufer mit dem Phänotyp CD34+CD38 kommen sowohl im Nabelschnurblut als auch im Knochenmark vor, aber Nabelschnurblutzellen mit dem Markersatz CD34+CD38 haben eine höhere klonogene Aktivität als hämatopoetische Zellen desselben Phänotyps, die aus dem Knochenmark erwachsener Spender isoliert wurden. Darüber hinaus proliferieren Nabelschnurblutzellen mit dem Immunphänotyp CD34+CD38 als Reaktion auf eine Stimulation durch Zytokine (IL-3, IL-6, G-CSF) schneller und produzieren in Langzeitkulturen 7-mal mehr Kolonien als Knochenmarkzellen.

Nabelschnurblut-Stammzellbanken

Für die richtige Entwicklung eines neuen Bereichs der praktischen Medizin – der Nabelschnurblutstammzelltransplantation – sowie für die Durchführung von Transplantationen hämatopoetischer Knochenmarkstammzellen ist ein ausgedehntes Netzwerk von Blutbanken notwendig, die in den USA und Europa bereits aufgebaut wurden. Die nationalen Netzwerke von Nabelschnurblutbanken sind in der Netcord Bank Association zusammengeschlossen. Die Zweckmäßigkeit der Schaffung einer internationalen Vereinigung von Nabelschnurblutbanken wird durch die Tatsache bestimmt, dass eine große Anzahl typisierter Nabelschnurblutproben benötigt wird, um unabhängige Transplantationen durchzuführen, was die Auswahl eines HLA-identischen Spenders ermöglicht. Nur die Einrichtung eines Systems von Banken mit Lagerung von Blutproben verschiedener HLA-Typen kann das Problem der Suche nach dem erforderlichen Spender wirklich lösen. Die Organisation eines solchen Nabelschnurblutbanksystems erfordert die vorläufige Entwicklung ethischer und rechtlicher Normen, die derzeit auf internationaler Ebene diskutiert werden.

Um Nabelschnurblutbanken in der Ukraine einzurichten, müssen eine ganze Reihe von Vorschriften und Dokumenten ausgearbeitet werden.

In erster Linie geht es dabei um die Standardisierung der Methoden zur Entnahme, Fraktionierung und Einfrierung von Nabelschnurblut. Die Regeln für die Entnahme von Nabelschnurblut in Entbindungskliniken müssen gemäß den Anforderungen der medizinischen Ethik geregelt werden, um die Mindestmenge an Nabelschnurblut festzulegen, die eine erfolgreiche Transplantation gewährleistet. Verschiedene Kriterien zur Beurteilung der Qualität und Quantität hämatopoetischer Progenitorzellen sowie HLA-Typisierungsmethoden und Diagnosemethoden für genetische und infektiöse Krankheiten, die bei der Infusion von Nabelschnurblutzellen übertragen werden können, müssen verglichen und standardisiert werden, um gemeinsame Kriterien für die Auswahl gesunder Spender festzulegen. Auch die Frage der Schaffung getrennter Lagereinrichtungen für aus Nabelschnurblut gewonnenes Serum, Zellen und DNA muss diskutiert werden.

Es ist unbedingt erforderlich, ein Computernetzwerk für Nabelschnurblutdaten zu organisieren und mit Knochenmarkspenderregistern zu verknüpfen. Für die Weiterentwicklung der Zelltransplantationsmedizin sind spezielle Protokolle für den Vergleich der Ergebnisse von Nabelschnurblut- und Knochenmarktransplantationen von HLA-identischen Verwandten und nicht verwandten Spendern erforderlich. Die Standardisierung der Dokumentation, einschließlich der Einverständniserklärung der Eltern, sowie die Benachrichtigung der Mutter oder Verwandten über beim Kind festgestellte genetische und/oder infektiöse Erkrankungen können zur Lösung der ethischen und rechtlichen Probleme der klinischen Verwendung von Nabelschnurblutzellen beitragen.

Die entscheidende Voraussetzung für die Entwicklung der Zelltransplantation in der Ukraine wird die Einführung des Nationalen Stammzellspendeprogramms und die Entwicklung der internationalen Zusammenarbeit mit anderen Ländern über die World Marrow Donor Association (WMDA), das US National Marrow Donor Program (NMDP) und andere Register sein.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die ersten Annahmen über die Möglichkeit der klinischen Verwendung von Nabelschnurblut, die bereits Anfang der 70er Jahre geäußert wurden, in den 80er Jahren durch die Ergebnisse von Tierversuchen bestätigt wurden. 1988 wurde die weltweit erste Transplantation von hämatopoetischen Nabelschnurblutzellen auf einen Menschen durchgeführt. Danach begann der Aufbau eines globalen Netzwerks von Nabelschnurblutbanken. Innerhalb von 10 Jahren näherte sich die Zahl der Patienten mit transplantierten hämatopoetischen Nabelschnurblutzellen 800. Unter ihnen waren Patienten mit verschiedenen Tumorerkrankungen (Leukämie, Lymphom, solide Tumoren) und Nicht-Tumorerkrankungen (angeborene Immundefekte, Anämie, mit Stoffwechselstörungen verbundene Erkrankungen).

Der Gehalt an frühen und determinierten Zellvorläufern im Nabelschnurblut ist höher als im peripheren Blut eines Erwachsenen. Hinsichtlich der Anzahl der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-bildenden Einheiten und ihres proliferativen Potenzials übertrifft Nabelschnurblut das periphere Blut von Erwachsenen auch nach der Gabe von Wachstumsfaktoren deutlich. In Langzeitzellkulturen in vitro wurde eine höhere proliferative Aktivität und Lebensfähigkeit von Nabelschnurblutzellen als von Knochenmarkszellen festgestellt. Kritische Momente bei der Nabelschnurblut-Stammzelltransplantation sind die Anzahl und das hämatopoetische Potenzial kernhaltiger Zellen, das Vorliegen einer Cytomegalievirus-Infektion, die HLA-Kompatibilität von Spender und Empfänger sowie das Körpergewicht und Alter des Patienten.

Die Transplantation von Nabelschnurblutstammzellen sollte jedoch als Alternative zur Knochenmarktransplantation zur Behandlung schwerer Bluterkrankungen, vor allem bei Kindern, in Betracht gezogen werden. Die klinischen Probleme der Nabelschnurblutzelltransplantation werden allmählich gelöst – es gibt bereits recht wirksame Methoden zum Sammeln, Trennen und Kryokonservieren von Nabelschnurblutzellen, es werden Bedingungen für die Bildung von Nabelschnurblutbanken geschaffen und die Methoden zum Testen kernhaltiger Zellen werden verbessert. Eine 3%ige Gelatinelösung und eine 6%ige Hydroxyethylstärkelösung sollten als optimal für die Trennung bei der groß angelegten Beschaffung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut beim Aufbau von Banken angesehen werden.

P. Perekhrestenko und Co-Autoren (2001) weisen zu Recht darauf hin, dass die Transplantation von Nabelschnurblutstammzellen ihren rechtmäßigen Platz im Komplex der therapeutischen Maßnahmen zur Überwindung hämatopoetischer Depressionen unterschiedlicher Genese einnehmen sollte, da Nabelschnurblutstammzellen eine Reihe bedeutender Vorteile aufweisen, von denen die wichtigsten die relative Einfachheit ihrer Beschaffung, das fehlende Risiko für den Spender, die geringe Kontamination neonataler Zellen mit Viren und die vergleichsweise niedrigen Transplantationskosten sind. Einige Autoren weisen darauf hin, dass die Transplantation von Nabelschnurblutzellen seltener von Komplikationen im Zusammenhang mit der Graft-versus-Host-Reaktion begleitet wird als die Transplantation von Knochenmarkszellen, was ihrer Meinung nach auf die schwache Expression von HLA-DR-Antigenen auf Nabelschnurblutzellen und deren Unreife zurückzuführen ist. Die Hauptpopulation kernhaltiger Zellen im Nabelschnurblut sind jedoch T-Lymphozyten (CD3-positive Zellen), deren Gehalt etwa 50 % beträgt, also 20 % weniger als im peripheren Blut eines Erwachsenen, aber die phänotypischen Unterschiede in T-Zell-Subpopulationen aus diesen Quellen sind unbedeutend.

Zu den Faktoren, die die Überlebensrate bei der Transplantation von Nabelschnurblutstammzellen direkt beeinflussen, zählen das Alter der Patienten (die besten Ergebnisse werden bei Empfängern im Alter von einem bis fünf Jahren beobachtet), eine frühzeitige Diagnose der Krankheit und die Form der Leukämie (die Wirksamkeit ist bei akuter Leukämie wesentlich höher). Von großer Bedeutung sind die Dosis der kernhaltigen Nabelschnurblutzellen sowie ihre HLA-Kompatibilität mit dem Empfänger. Es ist kein Zufall, dass die Analyse der klinischen Wirksamkeit der Transplantation von Nabelschnurblut-HSC in der Onkohämatologie die besten Behandlungsergebnisse bei Verwendung verwandter Transplantate zeigt: Das einjährige rezidivfreie Überleben erreicht in diesem Fall 63 %, während es bei nicht verwandten Transplantationen nur 29 % beträgt.

Das Vorhandensein einer großen Anzahl von Stammzellen im Nabelschnurblut und die hohe Repopulationskapazität neonataler hämatopoetischer Stammzellen ermöglichen deren Verwendung für allogene Transplantationen bei onkohämatologischen Patienten. Es ist jedoch zu beachten, dass die Rekapitulation der Hämatopoese nach der Transplantation von hämatopoetischen Zellen aus Nabelschnurblut zeitlich gestreckt ist: Die Wiederherstellung des Neutrophilengehalts im peripheren Blut wird üblicherweise bis zum Ende der 6. Woche beobachtet, und die Thrombozytopenie verschwindet normalerweise nach 6 Monaten. Darüber hinaus schließt die Unreife der hämatopoetischen Zellen aus Nabelschnurblut immunologische Konflikte nicht aus: Eine schwere akute und chronische Graft-versus-Host-Krankheit wird bei 23 bzw. 25 % der Empfänger beobachtet. Rückfälle einer akuten Leukämie werden bis zum Ende des ersten Jahres nach der Nabelschnurblutzelltransplantation in 26 % der Fälle beobachtet.

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