Die Rolle von Enzymen und Zytokinen in der Pathogenese der Arthrose

In den letzten Jahren haben Forscher große Aufmerksamkeit auf die Identifizierung der Proteasen gerichtet, die für den Abbau der extrazellulären Matrix des Gelenkknorpels bei Osteoarthrose verantwortlich sind. Nach modernen Konzepten spielen Matrix-Metalloproteasen (MMPs) eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Osteoarthrose. Bei Patienten mit Osteoarthrose werden erhöhte Werte von drei MMPs nachgewiesen – Kollagenasen, Stromelysine und Gelatinasen. Kollagenase ist für den Abbau von nativem Kollagen verantwortlich, Stromelysin für den Abbau von Kollagen Typ IV, Proteoglykanen und Laminin, Gelatinase für den Abbau von Gelatine, Kollagen IV, Typ Vh XI und Elastin. Darüber hinaus wird die Anwesenheit eines weiteren Enzyms angenommen – Aggrecanase, die Eigenschaften von MMPs besitzt und für die Proteolyse von knorpeligen Proteoglykanaggregaten verantwortlich ist.

Im menschlichen Gelenkknorpel wurden drei Arten von Kollagenasen identifiziert, deren Werte bei Patienten mit Osteoarthritis deutlich erhöht sind: Kollagenase-1 (MMP-1), Kollagenase-2 (MMP-8) und Kollagenase-3 (MMP-13). Das gleichzeitige Vorkommen dreier unterschiedlicher Kollagenasentypen im Gelenkknorpel lässt darauf schließen, dass jeder von ihnen seine eigene spezifische Rolle spielt. Tatsächlich kommen Kollagenase-1 und -2 hauptsächlich in der oberflächlichen und oberen Zwischenzone des Gelenkknorpels vor, während Kollagenase-3 in der unteren Zwischenzone und in der tiefen Zone vorkommt. Zudem haben die Ergebnisse immunhistochemischer Studien gezeigt, dass mit fortschreitender Osteoarthritis der Kollagenase-3-Spiegel ein Plateau erreicht und sogar abfällt, während der Kollagenase-1-Spiegel allmählich ansteigt. Es gibt Hinweise darauf, dass bei Osteoarthritis Kollagenase-1 hauptsächlich am Entzündungsprozess im Gelenkknorpel beteiligt ist, während Kollagenase-3 am Gewebeumbau beteiligt ist. Kollagenase-3, die im Knorpel von Patienten mit OA exprimiert wird, baut Kollagen Typ II stärker ab als Kollagenase-1.

Von den Vertretern der zweiten Gruppe der Metalloproteasen wurden drei auch im menschlichen Stromelysin identifiziert: Stromelysin-1 (MMP-3), Stromelysin-2 (MMP-10) und Stromelysin-3 (MMP-11). Heute ist bekannt, dass nur Stromelysin-1 am pathologischen Prozess der Osteoarthrose beteiligt ist. Stromelysin-2 lässt sich in der Synovialmembran von Patienten mit Osteoarthrose nicht nachweisen, kommt jedoch in sehr geringen Mengen in den Synovialfibroblasten von Patienten mit rheumatoider Arthritis vor. Stromelysin-3 findet sich auch in der Synovialmembran von Patienten mit rheumatoider Arthritis in der Nähe von Fibroblasten, insbesondere in Fibrosezonen.

In der Gruppe der Gelatinasen im menschlichen Knorpelgewebe wurden nur zwei identifiziert: 92 kD Gelatinase (Gelatinase B oder MMP-9) und 72 kD Gelatinase (Gelatinase A oder MMP-2); bei Patienten mit Osteoarthritis wird ein Anstieg des Spiegels der 92 kD Gelatinase festgestellt.

Kürzlich wurde eine weitere Gruppe von MMPs identifiziert, die auf der Oberfläche von Zellmembranen lokalisiert sind und als Membran-MMPs (MMP-MT) bezeichnet werden. Diese Gruppe umfasst vier Enzyme – MMP-MT1 – MMP-MT-4. MMP-MT-Expression wurde im menschlichen Gelenkknorpel nachgewiesen. Obwohl MMP-MT-1 Kollagenase-Eigenschaften besitzt, sind die beiden Enzyme MMP-MT-1 und MMP-MT-2 in der Lage, Gelatinase-72 kDa und Kollagenase-3 zu aktivieren. Die Rolle dieser MMP-Gruppe in der Pathogenese von Arthrose bedarf der Klärung.

Proteinasen werden in Form eines Zymogens sezerniert, das durch andere Proteinasen oder organische Quecksilberverbindungen aktiviert wird. Die katalytische Aktivität von MMPs hängt vom Vorhandensein von Zink in der aktiven Zone des Enzyms ab.

Die biologische Aktivität von MMPs wird durch spezifische TIMPs gesteuert. Bisher wurden drei TIMP-Typen identifiziert, die in menschlichem Gelenkgewebe vorkommen: TIMP-1–TIMP-3. Ein vierter TIMP-Typ wurde identifiziert und geklont, konnte jedoch in menschlichem Gelenkgewebe noch nicht nachgewiesen werden. Diese Moleküle binden spezifisch an das aktive Zentrum von MMPs, obwohl einige von ihnen auch an das aktive Zentrum von 72 kD Progelatinase (TIMP-2, -3, -4) und 92 kD Progelatinase (TIMP-1 und -3) binden können. Es gibt Hinweise darauf, dass bei OA ein Ungleichgewicht zwischen MMPs und TIMPs im Gelenkknorpel besteht, was zu einem relativen Mangel an Inhibitoren führt, möglicherweise teilweise bedingt durch einen Anstieg des aktiven MMP-Spiegels im Gewebe. TIMP-1 und -2 kommen im Gelenkknorpel vor und werden von Chondrozyten synthetisiert. Bei Osteoarthrose wird ausschließlich Typ-I-TIMP in der Synovialmembran und Synovialflüssigkeit nachgewiesen. TIMP-3 kommt ausschließlich in der extrazellulären Matrix (ECM) vor. TIMP-4 hat fast 50 % der Aminosäuresequenz mit TIMP-2 und 38 % mit TIMP-1 gemeinsam. In anderen Zielzellen ist TIMP-4 für die Modulation der Aktivierung der 72 kD Progelatinase auf der Zelloberfläche verantwortlich, was auf eine wichtige Rolle als gewebespezifischer Regulator der ECM-Remodellierung hindeutet.

Ein weiterer Mechanismus zur Kontrolle der biologischen Aktivität von MMPs ist ihre physiologische Aktivierung. Es wird angenommen, dass Enzyme aus der Familie der Serin- und Cysteinproteasen, wie AP/Plasmin bzw. Cathepsin B, physiologische Aktivatoren von MMPs sind. Erhöhte Urokinase- (uAP) und Plasminspiegel wurden im Gelenkknorpel von Patienten mit Osteoarthritis gefunden.

Obwohl in Gelenkgeweben mehrere Arten von Cathepsinen vorkommen, gilt Cathepsin-B als der wahrscheinlichste Aktivator von MMPs im Knorpel. In menschlichem Gelenkgewebe wurden physiologische Inhibitoren von Serin- und Cysteinproteasen gefunden. Die Aktivität des AP-1-Inhibitors (IAI-1) sowie der Cysteinproteasen ist bei Patienten mit Osteoarthritis reduziert. Ähnlich wie bei MMP/TIMP ist es das Ungleichgewicht zwischen Serin- und Cysteinproteasen und ihren Inhibitoren, das die erhöhte Aktivität von MMPs im Gelenkknorpel von Patienten mit Osteoarthritis erklären kann. Außerdem können MMPs sich gegenseitig aktivieren. Beispielsweise aktiviert Stromelysin-1 Kollagenase-1, Kollagenase-3 und 92 kD Gelatinase; Kollagenase 3 aktiviert 92 kD Gelatinase; MMP-MT aktiviert Kollagenase-3, und Gelatinase-72 kDa verstärkt diese Aktivierung; MMP-MT aktiviert auch Gelatinase 72 kDa. Zytokine können in drei Gruppen unterteilt werden: destruktiv (entzündlich), regulatorisch (einschließlich entzündungshemmend) und anabole (Wachstumsfaktoren).

Arten von Zytokinen (nach van den Berg WB et al)

Zerstörerisch	Interleukin-1 TNF-α Leukämie-Hemmfaktor Interleukin-17
Regulatorische	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Enzyminhibitoren
Anabole	Insulinähnliche Wachstumsfaktoren TGF-b Knochenmorphogenetische Proteine Morphogenetische Proteine aus Knorpel

Destruktive Zytokine, insbesondere IL-1, induzieren eine erhöhte Freisetzung von Proteasen und hemmen die Synthese von Proteoglykanen und Kollagenen durch Chondrozyten. Regulatorische Zytokine, insbesondere IL-4 und -10, hemmen die IL-1-Produktion, erhöhen die Produktion des IL-1-Rezeptorantagonisten (IL-1RA) und senken den NO-Synthase-Spiegel in Chondrozyten. Somit wirkt IL-4 IL-1 auf drei Arten entgegen: 1) Es reduziert die Produktion und verhindert so dessen Wirkungen, 2) es erhöht die Produktion des wichtigsten „Fängers“ IL-1RA und 3) es reduziert die Produktion des wichtigsten sekundären „Botenstoffs“ NO. Darüber hinaus reduziert IL-4 den enzymatischen Gewebeabbau. In vivo wird die optimale therapeutische Wirkung durch eine Kombination von IL-4 und IL-10 erzielt. Anabole Faktoren wie TGF-β und IGF-1 stören die Produktion oder Wirkung von IL-1 nicht wirklich, sondern zeigen die gegenteilige Wirkung, indem sie beispielsweise die Synthese von Proteoglykanen und Kollagen stimulieren und die Aktivität von Proteasen unterdrücken. TGF-β hemmt außerdem die Freisetzung von Enzymen und stimuliert deren Inhibitoren.

Proinflammatorische Zytokine sind für die erhöhte Synthese und Expression von MMPs im Gelenkgewebe verantwortlich. Sie werden in der Synovialmembran synthetisiert und diffundieren anschließend über die Synovialflüssigkeit in den Gelenkknorpel. Proinflammatorische Zytokine aktivieren Chondrozyten, die wiederum proinflammatorische Zytokine produzieren können. In von Osteoarthrose betroffenen Gelenken spielen vor allem Zellen der Synovialmembran die Rolle des Entzündungseffektors. Es sind die Synovozyten vom Makrophagentyp, die Proteasen und Entzündungsmediatoren sezernieren. Unter ihnen sind IL-f, TNF-α, IL-6, der Leukämie-inhibitorische Faktor (LIF) und IL-17 am stärksten an der Pathogenese der Osteoarthrose beteiligt.

Biologisch aktive Substanzen, die den Abbau von Gelenkknorpel bei Arthrose stimulieren

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-α
• Koloniestimulierende Faktoren: Makrophage (Monozyten) und Granulozyten-Makrophage
• Substanz P
• PGE ₂
• Plasminogenaktivatoren (Gewebe- und Urokinase-Typen) und Plasmin
• Metalloproteasen (Kollagenasen, Ellastasen, Stromelysine)
• Cathepsine A und B
• Trilsin
• Bakterielle Lipopolysaccharide
• Phospholipase Ag

Daten aus der Literatur deuten darauf hin, dass IL-1 und möglicherweise TNF-α die Hauptmediatoren der Gelenkgewebezerstörung bei Osteoarthrose sind. Es ist jedoch noch unbekannt, ob sie unabhängig voneinander wirken oder ob eine funktionelle Hierarchie zwischen ihnen besteht. Tiermodelle für Osteoarthrose haben gezeigt, dass eine Blockade von IL-1 die Zerstörung des Gelenkknorpels wirksam verhindert, während eine Blockade von TNF-α lediglich zu einer Verringerung der Entzündung im Gelenkgewebe führt. Erhöhte Konzentrationen beider Zytokine wurden in der Synovialmembran, der Synovialflüssigkeit und im Knorpel der Patienten gefunden. In Chondrozyten können sie die Synthese nicht nur von Proteasen (hauptsächlich MMP und AP) sondern auch von kleineren Kollagenen wie Typ I und III steigern und die Synthese von Kollagen Typ II und IX und von Proteoglykanen verringern. Diese Zytokine stimulieren außerdem reaktive Sauerstoffspezies und Entzündungsmediatoren wie _PGE2. Die Folge solcher makromolekularen Veränderungen im Gelenkknorpel bei Arthrose ist die Ineffektivität der Reparaturprozesse, was zu einem weiteren Abbau des Knorpels führt.

Die oben genannten proinflammatorischen Zytokine modulieren die Prozesse der MMP-Suppression/-Aktivierung bei Osteoarthrose. Beispielsweise könnte das Ungleichgewicht zwischen TIMP-1- und MMP-Spiegeln im Knorpel bei Osteoarthrose durch IL-1 vermittelt werden, da eine In-vitro-Studie zeigte, dass ein Anstieg der IL-1-beta-Konzentration zu einer Abnahme der TIMP-1-Konzentration und einer erhöhten MMP-Synthese durch Chondrozyten führt. Auch die AP-Synthese wird durch IL-1-beta moduliert. Die In-vitro-Stimulation von Gelenkknorpelchondrozyten mit IL-1 führt zu einem dosisabhängigen Anstieg der AP-Synthese und einem starken Abfall der iAP-1-Synthese. Die Fähigkeit von IL-1, die iAP-1-Synthese zu verringern und die AP-Synthese zu stimulieren, ist ein wirksamer Mechanismus für die Plasminbildung und MMP-Aktivierung. Plasmin ist zudem nicht nur ein Enzym, das andere Enzyme aktiviert, sondern auch durch direkte Proteolyse am Knorpelabbau beteiligt.

IL-ip wird als inaktiver Vorläufer mit einer Masse von 31 kD (Prä-IL-ip) synthetisiert und nach Abspaltung des Signalpeptids in ein aktives Zytokin mit einer Masse von 17,5 kD umgewandelt. In Gelenkgeweben, einschließlich der Synovialmembran, der Synovialflüssigkeit und des Gelenkknorpels, kommt IL-ip in aktiver Form vor. In-vivo-Studien haben die Fähigkeit der Synovialmembran bei Osteoarthrose gezeigt, dieses Zytokin zu sezernieren. Einige Serinproteasen sind in der Lage, Prä-IL-ip in seine bioaktive Form umzuwandeln. Bei Säugetieren wurden solche Eigenschaften nur bei einer Protease gefunden, die zur Familie der Cystein-Aspartat-spezifischen Enzyme gehört und als IL-1β-konvertierendes Enzym (ICF oder Caspase-1) bezeichnet wird. Dieses Enzym ist in der Lage, Prä-IL-ip spezifisch in biologisch aktives „reifes“ IL-ip mit einer Masse von 17,5 kD umzuwandeln. ICF ist ein 45 kD großes Proenzym (p45), das in der Zellmembran lokalisiert ist. Nach proteolytischer Spaltung des p45-Proenzyms entstehen zwei Untereinheiten, die als p10 und p20 bezeichnet werden und sich durch enzymatische Aktivität auszeichnen.

TNF-α wird ebenfalls als membrangebundener Vorläufer mit einer Masse von 26 kDa synthetisiert; durch proteolytische Spaltung wird es als aktive, lösliche Form mit einer Masse von 17 kDa aus der Zelle freigesetzt. Die proteolytische Spaltung erfolgt durch das TNF-α-konvertierende Enzym (TNF-AC), das zur Adamalizin-Familie gehört. AR Amin et al. (1997) fanden eine erhöhte Expression von TNF-AC-mRNA im Gelenkknorpel von Patienten mit Osteoarthritis.

Die biologische Aktivierung von Chondrozyten und Synovozyten durch IL-1 und TNF-α erfolgt über die Bindung an spezifische Rezeptoren auf der Zelloberfläche – IL-R und TNF-R. Für jedes Zytokin wurden zwei Rezeptortypen identifiziert – IL-IP Typ I und II sowie TNF-R Typ I (p55) und II (p75). IL-1PI und p55 sind für die Signalübertragung in Gelenkzellen verantwortlich. IL-1R Typ I hat eine etwas höhere Affinität zu IL-1beta als zu IL-1α; IL-1R Typ II hingegen hat eine höhere Affinität zu IL-1α als zu IL-α. Es ist unklar, ob IL-IP Typ II IL-1-Signale vermitteln kann oder lediglich die kompetitive Hemmung der Assoziation von IL-1 mit IL-1R Typ I bewirkt. Chondroitiden und synoviale Fibroblasten von Patienten mit Osteoarthrose enthalten große Mengen an IL-1PI und p55, was wiederum die hohe Empfindlichkeit dieser Zellen gegenüber der Stimulation durch die entsprechenden Zytokine erklärt. Dieser Prozess führt sowohl zu einer erhöhten Sekretion proteolytischer Enzyme als auch zur Zerstörung des Gelenkknorpels.

Eine Beteiligung von IL-6 am Krankheitsgeschehen bei Arthrose kann nicht ausgeschlossen werden. Diese Annahme basiert auf folgenden Beobachtungen:

• IL-6 erhöht die Anzahl der Entzündungszellen in der Synovialmembran,
• IL-6 stimuliert die Chondrozytenproliferation,
• IL-6 verstärkt die Wirkung von IL-1 bei der Steigerung der MMP-Synthese und der Hemmung der Proteoglykansynthese.

IL-6 kann jedoch die Produktion von TIMPs induzieren, beeinflusst jedoch nicht die Produktion von MMPs. Daher wird angenommen, dass dieses Zytokin an der Hemmung des proteolytischen Abbaus von Gelenkknorpel beteiligt ist, die über einen Rückkopplungsmechanismus erfolgt.

Ein weiteres Mitglied der IL-6-Familie ist LIF, ein Zytokin, das von Chondrozyten von Patienten mit Osteoarthrose als Reaktion auf die Stimulation durch die proinflammatorischen Zytokine IL-1p und TNF-a produziert wird. LIF stimuliert die Knorpelproteoglykanresorption sowie die MMP-Synthese und die NO-Produktion. Die Rolle dieses Zytokins bei Osteoarthrose ist noch nicht vollständig geklärt.

IL-17 ist ein 20–30 kD Homodimer mit einer IL-1-ähnlichen, jedoch deutlich abgeschwächten Wirkung. IL-17 stimuliert die Synthese und Freisetzung einer Reihe proinflammatorischer Zytokine, darunter IL-1p, TNF-α, IL-6 und MMP in Zielzellen wie menschlichen Makrophagen. Darüber hinaus stimuliert IL-17 die NO-Produktion durch Chondrozyten. Wie bei LIF ist auch die Rolle von IL-17 in der Pathogenese von Arthrose wenig erforscht.

Das anorganische freie Radikal NO spielt eine wichtige Rolle beim Abbau des Gelenkknorpels bei Arthrose. Chondrozyten von Patienten mit Arthrose produzieren sowohl spontan als auch nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen höhere Mengen an NO als normale Zellen. In Synovialflüssigkeit und Serum von Patienten mit Arthrose wurden hohe NO-Gehalte festgestellt – dies ist auf eine erhöhte Expression und Synthese der induzierten NO-Synthase (hNOC) zurückzuführen, dem für die NO-Produktion verantwortlichen Enzym. Kürzlich wurde die DNA der chondrozytenspezifischen hNOC kloniert und die Aminosäuresequenz des Enzyms bestimmt. Die Aminosäuresequenz weist eine 50-prozentige Identität und 70-prozentige Ähnlichkeit mit der für Endothel- und Nervengewebe spezifischen hNOC auf.

NO hemmt die Synthese von Makromolekülen der extrazellulären Matrix des Gelenkknorpels und stimuliert die Synthese von MMP. Darüber hinaus geht eine erhöhte NO-Produktion mit einer verminderten Synthese des IL-IP-Antagonisten (IL-1RA) durch Chondrozyten einher. Ein Anstieg des IL-1-Spiegels und ein Abfall des IL-1RA-Spiegels führen somit zu einer Überstimulation von NO in Chondrozyten, was wiederum zu einem verstärkten Abbau der Knorpelmatrix führt. Es gibt Berichte über den therapeutischen Effekt eines selektiven hNOC-Inhibitors in vivo auf das Fortschreiten der experimentellen Osteoarthrose.

Natürliche Zytokininhibitoren verhindern direkt die Bindung von Zytokinen an Zellmembranrezeptoren und reduzieren so deren entzündungsfördernde Aktivität. Natürliche Zytokininhibitoren lassen sich anhand ihrer Wirkungsweise in drei Klassen einteilen.

Die erste Klasse von Inhibitoren umfasst Rezeptorantagonisten, die die Bindung des Liganden an seinen Rezeptor verhindern, indem sie um die Bindungsstelle konkurrieren. Bisher wurde ein solcher Inhibitor nur für IL-1 gefunden – es handelt sich um den oben erwähnten kompetitiven Inhibitor des IL-1/ILIP-Systems IL-1 PA. IL-1 PA blockiert viele Effekte, die im Gelenkgewebe bei Arthrose beobachtet werden, darunter die Synthese von Prostaglandinen durch Synovialzellen, die Produktion von Kollagenase durch Chondrozyten und den Abbau von BM des Gelenkknorpels.

IL-1RA kommt in verschiedenen Formen vor – einer löslichen (rIL-1RA) und zwei interzellulären (μIL-lPAI und μIL-1RAP). Die Affinität der löslichen Form von IL-1RA ist fünfmal höher als die der interzellulären Formen. Trotz intensiver wissenschaftlicher Forschung ist die Funktion der letzteren unbekannt. In-vitro-Experimente haben gezeigt, dass die Hemmung der IL-1beta-Aktivität eine 10- bis 100-mal höhere IL-1RA-Konzentration als normal erfordert, während unter In-vivo-Bedingungen eine tausendfache Erhöhung der IL-1RA-Konzentration erforderlich ist. Diese Tatsache könnte den relativen IL-1RA-Mangel und den IL-1-Überschuss in der Synovialmembran von Patienten mit Osteoarthrose teilweise erklären.

Die zweite Klasse natürlicher Zytokininhibitoren sind lösliche Zytokinrezeptoren. Beispiele für solche Inhibitoren beim Menschen, die mit der Pathogenese von Osteoarthritis in Zusammenhang stehen, sind rIL-1R und pp55. Lösliche Zytokinrezeptoren sind verkürzte Formen normaler Rezeptoren; wenn sie an Zytokine binden, verhindern sie deren Bindung an membrangebundene Rezeptoren von Zielzellen und wirken so über den Mechanismus des kompetitiven Antagonismus.

Der Hauptvorläufer löslicher Rezeptoren ist membrangebundenes IL-1RP. Die Affinität von rIL-IP zu IL-1 und IL-1RA ist unterschiedlich. So hat rIL-1RN eine höhere Affinität zu IL-1β als zu IL-1RA, und rIL-1PI weist eine höhere Affinität zu IL-1RA als zu IL-ip auf.

Es gibt auch zwei Arten löslicher Rezeptoren für TNF – pp55 und pp75. Wie lösliche IL-1-Rezeptoren werden sie durch „Shedding“ gebildet. In vivo finden sich beide Rezeptoren im Gewebe betroffener Gelenke. Die Rolle löslicher TNF-Rezeptoren in der Pathogenese der Osteoarthrose ist umstritten. Es wird angenommen, dass sie in niedrigen Konzentrationen die dreidimensionale Struktur von TNF stabilisieren und die Halbwertszeit des bioaktiven Zytokins verlängern, während hohe Konzentrationen von pp55 und pp75 die TNF-Aktivität durch kompetitiven Antagonismus verringern können. Wahrscheinlich kann pp75 als TNF-Träger fungieren und dessen Bindung an den membrangebundenen Rezeptor erleichtern.

Die dritte Klasse natürlicher Zytokinhemmer wird durch eine Gruppe entzündungshemmender Zytokine repräsentiert, zu denen TGF-beta, IL-4, IL-10 und IL-13 gehören. Entzündungshemmende Zytokine reduzieren die Produktion entzündungsfördernder und einiger Proteasen und stimulieren die Produktion von IL-1RA und TIMP.